论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌的感染已经成为世界的焦点问题,因为它不仅严重威胁着人类的健康,还造成了巨大的经济损失。金葡菌是引起人类化脓感染的重要致病菌,也是引起食物污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。该菌在自然界中无处不在,因此污染食品的几率较大。食品被污染后,在适合的温度条件下,金黄色葡萄球菌将大量繁殖并产生肠毒素,从而引起消费者食物中毒。因此,建立金黄色葡萄球菌的快速检测方法具有重要的现实意义。本研究以表面蛋白为检测靶标,初步建立了双抗体夹心ELISA检测方法,为金黄色葡萄球菌快速检测方法在食品安全检测、临床检验等方面的应用奠定了基础。本研究首先根据表面蛋白IsdA和SdrD基因设计特异性引物,以金葡菌标准菌株基因组为模板进行PCR扩增,分别获得了大小为801 bp与2043 bp的基因片段。将基因片段连接至表达载体pET26b,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,两种基因在宿主细胞中均能够较好的表达,重组蛋白的分子量大小分别约为38 kDa和99 kDa。利用免疫亲和层析对目标蛋白进行纯化,并分别免疫新西兰白兔和白拉克母鸡,制备多克隆抗体。利用纯化的IsdA鸡源多抗(IsdA-IgY)作为捕获抗体、SdrD兔源多抗(SdrD-IgG)作为检测抗体,初步完成金黄色葡萄球菌双抗体夹心ELISA方法的建立。优化的最佳检测条件为：捕获抗体IsdA-IgY包被量为2μg/well,检测抗体稀释倍数为500倍,封闭液为1×PBS的0.5%的脱脂乳粉,酶标二抗的稀释倍数为10000倍。检测方法对于三株金黄色葡萄球菌分型菌株(ATCC49525、ATCC49521和ATCC55804)的检测限(LOD)分别为1.44×107 cfu/mL、 9.14×106 cfu/mL、7.14×106 cfu/mL,定量限(LOQ)分别为5.74×107 cfu/mL、3.59×107 cfu/mL.3.29×107 cfu/mL。通过对双抗体夹心ELISA方法板内和板间变异程度的检测,表明本研究所建立的方法具有良好的稳定性。用此方法检测16株金黄色葡萄球菌分离菌株,均显示出阳性结果,体现出该方法对金黄色葡萄球菌的检测具有普遍适用性。