【摘 要】
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羊地方性鼻内腺瘤（Enzootic nasal adenocarcinoma,ENA）是一种慢性、进行性、接触性的动物传染病。ENA由绵羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus of sheep,ENTV-1）和山羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2）所引起。ENTV-1只感染绵羊,ENTV-2
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费（SWU118072）； 国家自然科学基金（31902256）；
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羊地方性鼻内腺瘤（Enzootic nasal adenocarcinoma,ENA）是一种慢性、进行性、接触性的动物传染病。ENA由绵羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus of sheep,ENTV-1）和山羊地方性鼻内肿瘤病毒（Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2）所引起。ENTV-1只感染绵羊,ENTV-2只感染山羊,ENTV-2主要导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变。该病已呈现世界性分布;我国于1984年在内蒙古地区首次报道ENA病例,目前该病已经在我国国内广泛分布。2018年7月以来,重庆多个山羊养殖场出现疑似山羊地方性鼻内肿瘤病。Ⅰ.临床诊断与分子诊断确诊在重庆某山羊养殖场内观察山羊的临床症状,病情严重的山羊消瘦且鼻腔外毛发脱落,鼻腔内分泌大量浆液性鼻液但体温无明显变化,将该病羊处死后对病羊尸体进行剖检,观察腹腔与胸腔中的内脏均无明显病理变化。最明显的病变集中在鼻腔内,有大量粉红色或灰白色桑葚状增生物。本实验共采样27份,其中有15只山羊已经表现出了临床症状,而12只山羊尚无临床表现,选取5只表现出临床症状的病羊组织使用Trizol法提取RNA并反转录。其中多数样本通过PCR法成功扩增出目的片段,经过测序与BLAST发现为ENTV-2基因片段。随后我们自行设计引物并成功扩增出ENTV-2重庆株的全基因组序列。Ⅱ.遗传进化分析以ENTV-2全基因组序列为基础,应用MEGA5.1软件在Bootstrap置信值为500的条件下采用邻接法对ENTV-2的全基因组序列、ENTV-1和JSRV的代表性病毒株进行系统发育分析。可见ENTV-2、ENTV-1与JSRV有明显不同,所有的ENTV-2株都聚集在一个大的分枝上,而ENTV-1和JSRV则紧密聚集在另一个分枝上。ENTV-2毒株表现出高度的遗传多样性,同时ENTV-2是独立于ENTV-1与JSRV这两种病毒而进化的,分析结果也表明ENTV-2的系统发育可能与地理聚集相关。Ⅲ.荧光定量检测方法的建立通过设计特异性检测引物和构建标准质粒,建立一种以Eva Green作为荧光染料的实时荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR和SYBR Green I染料在灵敏性和重复性等方面作对比实验。Eva Green real-time q PCR的测定系数具有良好的线性关系,其中R~2=0.996,斜率=-3.327。Eva Green法的扩增效率为99.8%,结果相较于SYBR Green I q PCR更加准确。该方法能够检测到低至3.0×10~1拷贝的病毒粒子,相较于常规PCR灵敏10倍。本研究是首次在重庆地区发现ENTV-2,并取得全长7279 bp的ENTV-2 CQ株全基因组,采用邻接法得到进化树并分析得出毒株CQ1单独形成了一个分支,且与陕西株及四川株进化关系较为密切,表明ENTV-2的系统发育可能与地理聚集相关,同时也成功建立Eva Green作为染料的实时荧光定量PCR检测方法。世界范围内除澳大利亚和新西兰外,ENTV-2已经广泛存在,虽然患病率不高但发病后死亡率接近100%。由于ENTV-2存在逃避宿主免疫系统的能力,目前没有检测到ENTV-2抗体的报道;也不能体外分离培养ENTV-2。ENTV-2国内疫情报道和基因信息较少,检测方法滞后等等因素都为防控ENTV-2疫情产生了负面影响。本次实验建立的荧光定量方法可用于该病的早期检测。以上研究也将为ENTV-2的流行病学、早期诊断和疾病防控提供重要借鉴。
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