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次级醇脱氢酶是用于手性化合物合成的重要生物催化剂,能有效地催化不对称还原生成单一构型的手性醇,在医药、化工、食品、农药等领域有重要的应用。嗜热醇脱氢酶由于具有良好的热稳定性和溶剂耐受性而备受关注。大多数生物酶离实际应用尚有距离,本课题旨在发现具有优良催化性能的醇脱氢酶,并针对基因工程菌表达易形成包涵体、酶易失活、NADP(H)辅酶利用应用成本高等普遍性问题展开研究。主要选取了实验室现有的两个高活力的醇脱氢酶进行包涵体的优化、抗氧化及辅酶依赖性的分子改造,并探讨相关分子机理。1.源自Yokenella sp.WZY002的烯醇/苄醇脱氢酶YsADH是新型的NAD(P)H依赖型的次级醇脱氢酶,该酶具有突出的生物特性:较广的温度适用范围(25-75℃);高活力(在65℃最适条件下该酶活力Vmax高达629.4±25.2 U/mg);热稳定性好(65℃水浴6 h后保留54.5%的残余活力);有着广泛的有机溶剂耐受性及稳定性(20%的甲醇、丙酮、DMSO保持24 h,仍保留>80%的残余活力);从动力学常数分析,同时其还原活力明显高于氧化活力,如苄醛/巴豆醛的Kcat/Km分别为苯甲醇/巴豆醇的136和11倍。普遍的研究报道,苄醇脱氢酶随着底物浓度的增加其活力易受抑制,而YsADH的底物浓度抑制常数Ki值比及其他同类酶高2-3个数量级。同时,YsADH有较广的底物谱,其中不饱和醛/酮或醇的比活力明显高于饱和醛/酮或醇的比活力;更进一步来说,在不饱和还原反应底物中,脂肪族醛和苄烯丙基的醛较芳香酮和烯丙基的酶活性更高些。YsADH对不同类底物的活力:巴豆醛(2-丁烯醛)>2-己烯醛>2-辛烯醛>2-葵希醛,表明C=C的β侧链的空间位阻对酶活有很大的影响。比较1-丁醇(56.0±0.3U/mg)和巴豆醇(相对活力100%)的氧化活力,可以看出C=C双键在生物催化过程中有非常重要的作用。但是构建工程菌诱导表达后发现,重组酶YsADH易形成包涵体,对其进行包涵体表达优化:从外界因素出发即改善诱导条件,发现降低诱导温度及诱导剂IPTG浓度有利于可溶性表达,在优化条件下可溶YsADH约占总表达蛋白的5%。其他的尝试如诱导前45℃热击30 min或加入有机溶剂,均无明显改善效果。2.源自超嗜热厌氧菌Thermococcus guaymsensis的醇脱氢酶TgADH是NADP+依赖型且易氧失活的醇脱氢酶。本课题从理性设计及定向进化两方面改造TgADH的氧耐受性,拟阐明热稳定氧化还原酶的新型氧失活机制,包括关键氨基酸的种类、位点以及作用方式等。建立了一种简单快速的适用于理性设计及定向进化的高通量筛选方法,该法适用于热稳定醇脱氢酶的分子改造。理性设计的点饱和突变结果发现Cys213对TgADH的氧化失活起着很重要的作用,它位于酶的活性中心附近的η折叠上,氨基酸Gly/Ala/Leu的替换对酶活的提高都有正向效果,其中C213G突变体最为突出,与对照相比起酶活提高了 1.5倍。此外,一些侧链结构较复杂的氨基酸残基替换,如芳香族类或碱性氨基酸,不利于酶的热稳定性。3.醇脱氢酶TgADH属于NADP(H)依赖型,由于NADP(H)价格高且其化学结构不稳定,因此,我们利用蛋白质工程技术改造TgADH使其成为NAD(H)依赖型或是能同时利用NAD(H)及NADP(H),提高TgADH作为催化剂的经济性并拓宽其应用范围。实验以蛋白结构信息为基础,结合已有理论推测出TgADH与辅酶结合相关的4个氨基酸位点Gly208、Ser209、Arg210、Arg228,其中Ser209和Arg228尤为重要。Ser209不能与NAD+形成氢键,而Ser209替换成为Asp209后能与NAD+形成两个新的氢键,Arg228替换成为Phe228产生pi-pi相互作用,有助于提高利用NAD+的能力。突变酶Ser209Asp/Arg228Phe对NAD.+或NADP.+两种辅酶都具有较好的结合能力,最适温度为80℃,其以NADP+为辅酶时最适pH为10.5,Vmax/Km值比野生型TgADH提高了4倍,而以NAD+为辅酶时最适pH为8.5,Vmax/Km也大于野生型TgADH的Vmax/Km值。此外,对NAD(H)利用效果较好的90%的正向突变子其辅酶的最适pH均从10.5变化为8.5。