四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)鳃结构发育以及应对盐度和低温胁迫的影响研究

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本文主要应用形态学、组织学和分子生物学等技术对四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)鳃的基本结构和形态发育、不同盐度下鳃组织结构变化及其在低温条件下的转录组变化进行分析,旨在了解四指马鲅鳃组织结构特征及其对环境的适应特征,丰富四指马鲅的基础生物学资料,为优化四指马鲅养殖技术提供理论参考。主要研究结果有以下几点:1.四指马鲅鳃组织结构及其早期发育研究为了解四指马鲅鳃的组织结构和发育过程,本研究采用组织切片和透射电镜技术对人工培育四指马鲅鳃结构及其早期(1~35日龄)发育进行观察。结果显示,鳃耙列齿状,鳃丝梳状排列在鳃弓上,鳃小片排列在鳃丝两边。透射电镜下鳃小片主要由线粒体丰富细胞(Ι型和Π型)、扁平上皮细胞、柱细胞、血细胞、黏液细胞和未分化细胞组成。四指马鲅鳃早期发育显示,1日龄鳃原基形成;3日龄出现鳃弓,有扁平上皮细胞和血细胞;5日龄出现鳃小片,鳃小片上有柱细胞,基部有线粒体丰富细胞;18日龄鳃小片增多,鳃结构完善;35日龄鳃结构基本和成鱼一致。根据发育特点将其分3个阶段:第1阶段(0~3日龄)为原基期,鳃原基形成但未分化,仔鱼主要靠鳍褶、皮肤和卵黄囊上的微血管进行呼吸;第2阶段(4~17日龄)为鳃结构分化、发育期,鳃耙、鳃弓、鳃丝、鳃小片逐渐形成,具备鳃基本的结构特点;第3阶段(18~35日龄)为鳃结构完善期,鳃组织发育主要体现在数量和形状的变化。2.不同盐度对四指马鲅幼鱼存活与鳃组织形态变化的影响为了探究不同盐度对四指马鲅幼鱼存活与鳃组织结构变化的规律,指导四指马鲅苗种生产。本研究采用组织学方法对不同盐度下(0、5、10、15、20‰)四指马鲅幼鱼的鳃组织结构进行研究。结果显示,0‰条件下,四指马鲅幼鱼在12 h之内全部死亡,5‰组幼鱼死亡率成为6.6%,对照组幼鱼无死亡,15‰和20‰组幼鱼死亡率分别为33.3%和60%,表明其较高盐环境更能适应低盐环境,且骤降到0‰条件下鱼体不能存活。10‰条件下,四指马鲅幼鱼的鳃小片排列紧密,线粒体丰富细胞主要分布在鳃小片基部。5‰条件下鳃小片的长度和间距分别为45.19±3.18μm和17.65±1.43μm,20‰条件下鳃小片的长度和间距分别是36.67±3.81μm和11.56±3.81μm;5‰条件下鳃小片的宽度为5.32±1.02μm,20‰条件下鳃小片的宽度为8.78±2.22μm,表明随着盐度的增加,鳃小片的长度和间距减少,而鳃小片宽度增加,且差异均显著(P<0.05)。20‰条件下,鳃小片的远端可见到线粒体丰富细胞,扁平上皮细胞出现一定程度的脱落或分离现象。扫描电镜结果显示,线粒体丰富细胞有两种类型,分别是Ⅱ型和Ⅰ型。5‰条件下,线粒体丰富细胞出现两种类型。主要以Ⅱ型为主,顶膜开口较大,表面有大量微绒毛,扁平上皮细胞表面有隆起的微嵴,形成指纹样回路;10‰条件下,出现Ⅰ型线粒体丰富细胞,扁平上皮细胞表面微嵴形态不规则,细胞间的界限不明显;15‰和S20‰条件下,均以Ⅰ型结构为主,并且随着盐度增加,顶膜加深,线粒体丰富细胞数量增多。扁平上皮细胞表面微嵴隆起幅度小,指纹样的回路不明显。四指马鲅幼鱼鳃组织结构的变化与其所处的环境盐度条件有关。3.低温胁迫条件下四指马鲅鳃转录组变化研究为了探究四指马鲅鳃受到低温胁迫后的转录组变化情况,以体长5.0±0.5 cm,体质量1.5±0.4 g的四指马鲅作为实验材料,分别在低温胁迫组(16℃±0.5℃)和常温组(25℃±0.5℃)的第0h(NT)、2h(LT2)、6h(LT6)、12h(LT12)取样。提取RNA进行转录组测序。对测序的数据进行De novo组装得到76878条Unigenes,平均长度为820.80bp。Unigenes的数据库注释结果如下:57093(73.77%)个基因注释到NR库,75585(97.66%)个基因注释到NT库,23145(29.91%)个基因注释到COG库,51375(66.38%)个基因注释到Swiss Prot库,30774(39.76%)个基因注释到GO库,50361(65.07%)个基因注释到KEGG库。进行不同实验组间差异表达基因分析:NT vs LT2组的差异表达基因共有3296个,其中1899个基因上调,1397个基因下调;LT2 vs LT6组的差异表达基因共有2134个,其中941个基因上调,1193个基因下调;LT6 vs LT12的差异表达基因有890个,其中533个基因上调,357个基因下调。差异表达基因富集分析发现:四指马鲅低温胁迫诱导的差异基因极显著富集在生物节律、类固醇合成、免疫反应、能量代谢、信号转导和DNA复制等信号通路中。该研究结果为了解四指马鲅低温适应机制提供重要依据。
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