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椰子(CocosnuciferaL.)是热带地区重要的油料经济作物,其胚乳可积累丰富的中链脂肪酸(约60%),而月桂酸含量约为50%,因此,椰子是研究中链脂肪酸合成和积累的热点之一。本研究以实验室前期研究结果为基础,将在椰子胚乳油脂合成过程中对中链脂肪酸起决定性作用的三个功能基因β-酮脂酰基载体蛋白合成酶(KASI)、脂酰基载体蛋白硫脂酶(FatB3)和溶血磷脂酰基转移酶(LPAAT)使用Cre/loxP多基因载体重组技术分别构建了两基因共表达FatB3-LPAAT系统、两基因共表达FatB3-KASI系统和三基因共表达FatB3-LPAAT-KASI重组载体,再分别转入野生型拟南芥中进行种子特异性过表达,通过检测基因的表达情况及转基因种子脂肪酸组成成分及含量,进一步验证这三个基因在中链脂肪酸油脂合成过程中的共表达协同作用。首先,利用Cre/LoxP多基因载体重组技术构建多基因共表达载体。先对各个基因分别构建启动子/基因/终止子的表达模块;其中,FatB3的启动子为种子特异性启动子Napin,而LPAAT和KASI的启动子分别为在拟南芥种子胚和胚乳中特异性表达的启动子At5400和At16460;三个基因的终止子均为来源于植物表达载体pCAMBIA1300S的终止子NOS。将FatB3表达模块和LPAAT表达模块进行重组成两基因FatB3-LPAAT系统,再将FatB3表达模块和KASI表达模块进行重组成两基因FatB3-KASI系统,最后使用重组好的FatB3-LPAAT表达模块和KASI表达模块进行重组成三基因FatB3-LPAAT-KASI系统。其次,通过农杆菌蘸花法将构建的多基因植物表达载体分别转入拟南芥中进行表达以验证多基因的协同作用。对T2代转基因植株叶片提取基因组DNA,并通过PCR方法筛选转基因阳性植株。再对转基因阳性植株种子提取RNA,并通过荧光定量PCR方法来检测各个基因在转基因植株中的表达量,筛选表达量较高的纯合株系进行下一步脂肪酸分析。最后,对转基因拟南芥种子进行脂肪酸分析。转基因拟南芥T3代纯合子脂肪酸分析结果表明:1.FatB3-LPAAT、FatB3-KAS 和FatB3-LPAAT-KASI转基因植株种子所产生的C12:0(相对百分含量)比野生型至少增加了 395%、124%和134%;类似地,FatB3-LPAAT、FatB3-K4SI和FatB3-LPAAT-KASI转基因植株种子的C14:0也比野生型种子至少增加了 383%、102%和106%;其它种类脂肪酸未显示出明显差异变化。2.FatB3-LPAAT转基因植株种子产生的C14:0(相对百分含量)比FatB3-KASI转基因植株种子和FatB3-LPAAT-KASI转基因植株种子产生的C14:0分别多了 92%和58%,类似地,FatB3-LPAAT-K4SI转基因植株种子产生的C12:0比FatB3-LPAAT和FatB3-KASI多了 19%和116%。该结果显示椰子FatB3和LPAAT在植物中的共表达比三基因FatB-LPAAT-KASI和两基因FatB3-LPAAT共表达产生中链脂肪酸效果要好。3.对转基因种子总脂肪酸含量分析发现FatB3-LPAAT、FatB3-KASI和FatB3-LPAAT-KASI转基因植株种子比野生型种子分别至少增加了 47%、70%和56%,而三个转基因株系间的总脂肪酸含量无显著性差异。该结果表明:在椰子中链脂肪酸合成和积累过程中,起主要作用的还是椰子FatB3和LPAAT,而椰子KASI不管是在改变脂肪酸组成成分或是增加总脂肪酸含量方面并未起到非常明显的作用。综上所述,本实验采用Cre/LoxP系统成功构建FatB3-LPAAT、FatB3-KASI及FatB3-LPAAT-KASI三种多基因系统,并转入拟南芥中进行种子特异性共表达,初步分析了三个基因组合共表达趋势,为提高植物合成中链脂肪酸提供了一个可能的方案及其今后在植物脂肪酸代谢基因工程的应用提供了一定的理论基础。