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研究背景及目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是导致我国乃至全球各类癌症相关疾病死亡的主要原因之一,我国结直肠癌发病率逐年上升,超过20%的患者在进行临床诊断时已是晚期,无手术根治机会而只能接受保守治疗。虽然目前根据RAS、BRAF状态不同,可有不同的治疗方案可选择,但仅限于后线治疗,抗EGFR受体治疗也只适用于RAS野生型、BRAF V600E突变患者,然而西妥昔单抗和帕尼单抗也仅对约10%~20%的大肠癌患者有效。因此,一线化疗方案仍然是最优先的选择。奥沙利铂（Oxaliplatin,OXA）作为双功能烷基化剂是结直肠癌一线化疗的关键药物,可共价结合DNA,形成铂-DNA复合物,抑制DNA复制和转录。尽管奥沙利铂类化疗具有良好的临床疗效,但是大多数患者随着时间与药物剂量的增加,对化疗药物治疗反应下降、出现切除后复发,从而终止治疗。因此,探讨大肠癌对化疗药物反应性影响因素,具有潜在临床应用价值。可变剪接（Alternative Splicing,AS）是指相同的基因转录形成mRNA前体时,通过不同的剪切和拼接方式而产生不同的成熟mRNA的过程,其再进行翻译可以得到不同的蛋白质异构体。已有研究表明,可变剪接失调可促进肿瘤的发生,在大肠癌发生发展过程中起重要作用。同时化疗可影响可变剪接方式,增加药物抗肿瘤作用。有研究显示,奥沙利铂形成的DNA损伤会使Bcl-X基因剪接事件发生失调,激活促细胞凋亡的Bcl-xs的5’剪接位点,使Bcl-xs产生增加而促进肿瘤细胞的凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。但有文献报道,肿瘤细胞中Bcl-xl稳定过表达时,则可降低奥沙利铂诱导的细胞死亡,从而影响奥沙利铂的治疗效果。细胞核内凋亡染色质凝聚诱导物（Apoptotic chromatin condensation inducer,Acinus）是剪接相关复合体细胞凋亡和剪接相关蛋白（Apoptosis and splicing associated protein,ASAP）复合物和外显子连接复合物（Exon junction complex,EJC）的组分之一,它参与Bcl-X的剪接调控,特异性抑制促凋亡剪接异构体如Bcl-xs的形成,使抗凋亡功能的剪接异构体Bcl-xl产生占优势。然而,Acinus对Bcl-X的可变剪接调控是否可以影响奥沙利铂治疗的反应性尚不清楚。ART1是一种精氨酸特异性单ADP核糖基化酶,本课题组先前的研究表明ART1对大肠癌的侵袭、增殖及凋亡具有重要作用,ART1敲低可通过PI3K/Akt/NF-k B通路促进小鼠CT26细胞凋亡。另有文献报道,Acinus表达参与Akt/NF-k B通路的调节。那么,大肠癌ART1是否与Acinus有关,并通过其影响大肠癌细胞对奥沙利铂的反应性尚不清楚。本研究对此进行了初步研究,旨在为促进大肠癌细胞对奥沙利铂反应寻找靶点提供新的思路和实验依据。方法:1.ART1和Acinus在FOLFOX或CAPEOX化疗后手术切除患者大肠癌组织中的表达采用免疫组化法检测21例化疗后手术切除的大肠癌标本和13例相应切缘组织中ART1和Acinus的表达,并对Acinus阳性程度和TRG等级、ART1和Acinus的表达进行相关性分析。2.ART1影响大肠癌CT26细胞对奥沙利铂反应的检测实验大肠癌CT26细胞分三组:ART1未转染组（Un-transfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）。（1）ART1对奥沙利铂处理后大肠癌CT26细胞增殖的影响1)CCK8法检测奥沙利铂按不同时间处理三组大肠癌CT26细胞增殖活性变化。2)Edu法检测奥沙利铂处理三组大肠癌CT26细胞DNA合成能力变化。（2）ART1对奥沙利铂处理后大肠癌CT26细胞凋亡的影响1)Hoechst33258法检测奥沙利铂处理三组大肠癌CT26细胞凋亡小体形成的变化。2)流式细胞仪检测奥沙利铂处理三组大肠癌CT26细胞凋亡率变化。3)Western blot法检测奥沙利铂处理三组大肠癌CT26细胞凋亡相关蛋白Bcl2、Bak和Bax表达。（3）建立Balb/c小鼠移植瘤模型,并用奥沙利铂处理,检测移植瘤体积,Western blot法检测移植瘤凋亡相关蛋白Bcl2、Bak和Bax的表达。3.ART1影响大肠癌CT26细胞对奥沙利铂反应机制初步研究（1）用转录组测序方法对ART1未转染组（Un-transfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）大肠癌CT26细胞进行差异基因分析。（2）RT-q PCR法检测ART1未转染组（Un-transfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）大肠癌CT26细胞中Acinus、Bcl-xl和Bcl-xs mRNA的表达。（3）质粒转染敲低大肠癌CT26细胞ACIN1（ACIN1-shRNA）,以转入空载质粒（ACIN1-NC）为对照。（ACIN1为Acinus基因名称）。1)RT-q PCR法检测ACIN1-NC,ACIN1-shRNA组大肠癌CT26细胞Acinus、Bcl-xl和Bcl-xs mRNA表达2)Western blot法检测ACIN1-NC,ACIN1-shRNA组大肠癌CT26细胞Acinus、Bcl-xl和Bcl-xs蛋白表达（4）免疫荧光法检测经奥沙利铂处理的ART1未转染组（Un-transfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）CT26细胞Acinus的表达。（5）Western blot法检测经奥沙利铂处理的ART1未转染组（Untransfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）CT26细胞和移植瘤中Acinus、Bcl-xl和Bcl-xs蛋白水平。（6）Western blot法检测经奥沙利铂处理的ART1未转染组（Untransfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）CT26细胞中Pi3k/Akt/NFk B通路相关蛋白表达水平。结果:1.ART1和Acinus在FOLFOX或CAPEOX化疗后手术切除患者大肠癌组织中的表达免疫组化结果显示,ART1和Acinus在癌组织中的表达强度高于切缘组织（p<0.05）。Acinus的阳性强度与AJCC评估肿瘤退缩等级（tumor regression grade,TRG）呈正相关。在21例CRC组织中,ART1与Acinus的表达强度呈正相关（P<0.05）。2.ART1影响大肠癌CT26细胞对奥沙利铂反应（1）ART1对奥沙利铂处理后大肠癌CT26细胞增殖的影响1)CCK8检测结果显示,以浓度为30umol/ml的奥沙利铂处理ART1未转染组（Un-transfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFPsh ART1）CT26细胞24h,48h,72h,随着时间的增加,经奥沙利铂处理后GFP-sh ART1组细胞增殖抑制率明显增加（P<0.05）。2)Edu法检测结果显示,用奥沙利铂处理Un-transfected、GFP-vector、GFP-sh ART1组CT26细胞,与Un-transfected组和GFP-vector组相比,GFP-sh ART1组DNA合成能力明显减弱（P<0.05）。（2）ART1对奥沙利铂处理后大肠癌CT26细胞凋亡的影响1)Hoechst33258法检测结果显示,奥沙利铂处理ART1未转染组（Untransfected）,ART1空载组（GFP-vector）,ART1敲低组（GFP-sh ART1）CT26细胞,与Un-transfected组和GFP-vector组相比,GFP-sh ART1组凋亡小体的形成明显增加（P<0.05）。2)流式细胞仪的检测结果显示,奥沙利铂处理Un-transfected、GFPvector、GFP-sh ART1组CT26细胞,与Un-transfected组和GFP-vector组相比,GFP-sh ART1组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。3)Western blot法检测结果显示,奥沙利铂处理Un-transfected、GFPvector、GFP-sh ART1组CT26细胞,与Un-transfected组和GFP-vector组相比,GFP-sh ART1组细胞Bcl2蛋白质水平降低（P<0.05）,Bak和Bax的表达量增加（P<0.05）。4)成功接种大肠癌CT26细胞GFP-vector组、GFP-sh ART1组至小鼠侧腹部皮下1周后,按奥沙利铂5mg/kg处理小鼠2周。GFP-sh ART1组皮下移植瘤的体积明显小于GFP-vector组（P<0.05）。5)Western blot法检测结果表明,移植瘤小鼠GFP-sh ART1组与GFPvector组相比Bcl2蛋白表达水平降低,Bax和Bak蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。3.ART1影响大肠癌CT26细胞对奥沙利铂反应的机制初步研究（1）Un-transfected、GFP-vector、GFP-sh ART1大肠癌CT26细胞转录组测序,GFP-sh ART1组与Un-transfected组和GFP-vector组相比,spliceosome通路显著富集,Acinus为其中的差异基因,其在GFPsh ART1组显著下调。（2）RT-q PCR法检测结果显示,Un-transfected、GFP-vector、GFP-sh ART1组大肠癌CT26细胞中,与Un-transfected组和GFP-vector组相比,GFPsh ART1组Acinus和Bcl-xl mRNA表达水平明显降低（P<0.05）,Bclxs的mRNA水平明显升高（P<0.05）。（3）RT-q PCR法和Western blot法检测结果显示,大肠癌CT26细胞敲低ACIN1的ACIN1-shRNA组与空载对照ACIN1-NC组相比,Acinus的mRNA表达水平和Acinus-L、Acinus-S蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。ACIN1-shRNA组与ACIN1-NC组相比,Bcl-xl的mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bcl-xs的mRNA和蛋白水平明显升高（P<0.05）。（4）奥沙利铂处理Un-transfected、GFP-vector、GFP-sh ART1组大肠癌CT26细胞,24h后进行免疫荧光染色检测,GFP-sh ART1组Acinus水平明显低于Un-transfected组和GFP-vector组（P<0.05）。（5）Western blot法检测结果显示,奥沙利铂处理Un-transfected、GFPvector、GFP-sh ART1组大肠癌CT26细胞,GFP-sh ART1组Acinus-L,Acinus-S,Bcl-xl蛋白水平明显低于Un-transfected组和GFP-vector组,Bcl-xs蛋白表达水平升高（P<0.05）。（6）Western blot法检测结果显示,Balb/c小鼠移植瘤组织,较GFP-vector组相比,GFP-sh ART1组Acinus-L,Acinus-S,Bcl-xl蛋白表达水平降低,Bcl-xs蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。（7）Western blot法检测结果显示,奥沙利铂处理Un-transfected、GFPvector、GFP-sh ART1组大肠癌CT26细胞,GFP-sh ART1组P-Pi3k p85、Pi3k p85、P-Akt、NFk B蛋白水平明显低于Un-transfected组和GFP-vector组（P<0.05）,Akt蛋白表达无明显变化（P>0.05）。结论:1.ART1可抑制奥沙利铂对大肠癌CT26细胞生长抑制的作用,在影响大肠癌细胞对奥沙利铂治疗反应性降低中发挥作用。2.ART1影响大肠癌CT26细胞对奥沙利铂治疗反应性降低中发挥作用,与通过上调Acinus,影响可变剪接使Bcl-xl表达增加,Bcl-xs表达减少,进而抑制经奥沙利铂诱导的大肠癌CT26细胞凋亡有关。ART1可能通过Pi3k/Akt/NFk B通路促进Acinus的表达。ART1在大肠癌对奥沙利铂的反应性调节中可能具有重要作用,详尽机制有待进一步研究。