扇脉杓兰（Cypripedium japonicum Thunb.）为兰科杓兰属多年生草本植物,具细长的、横走的根状茎,叶片扇形;花序顶生,花大色艳,花期4-5月;蒴果近纺锤形,疏被微柔毛。生于海拔1000-2000 m的林下、灌木林下、林缘、溪谷旁、荫蔽斜坡等湿润和腐殖质丰富的土壤上,分布于陕西南部、甘肃南部、安徽、浙江、江西等地,日本也有分布。其具有一定药用价值,根状茎可入药,用于调经,祛风镇痛;皮肤瘙痒,无名肿毒等。自然状态下扇脉杓兰种子萌发率较低,限制了该物种的人工繁育及开发利用,研究发现,这与种胚形成有关。因此,研究扇脉杓兰种胚发育的分子机制具有一定的意义。为揭示扇脉杓兰种胚发育的分子机制,利用转录组测序、miRNA及降解组测序对扇脉杓兰种胚发育过程进行了研究,同时,根据转录组测序结果,对扇脉杓兰进行内参基因的筛选。研究的主要结果为:（1）利用高通量测序技术分析扇脉杓兰种胚发育过程中5个时期所涉及的基因表达情况。以差异表达倍数大于等于2,P值<0.05为标准,在4个相邻比较组（PTvs NP、PFvs PT、PFvs PS、PSvs PE）中分别筛选出13761、3940、4556和6349个差异表达的基因。经过GO和KEGG富集分析,发现这些差异表达基因主要参与多细胞生物发育、激素响应和胚胎发育结束于种子休眠期等生物学过程,其主要参与的代谢途径为植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢。发现在扇脉杓兰种胚发育过程中一些关于种胚发育、内源激素相关的基因发挥重要作用。其中,调控种胚发育的基因为EMB506、MSI1、BOB1、ARP7、NFYA1、ARF4、HCC1。一些生长素、细胞分裂素响应、信号转导相关的基因在5个发育时期存在差异表达并发挥一定的调控作用。（2）从扇脉杓兰转录组数据中筛选了ACT3、EF1、RPL26B、TIF3I1、SAMDC、CYP22、PP2A3、TUBB3、RPS4、UBC2、UPL1、RAN1共12个看家基因作为候选内参基因,以扇脉杓兰的幼根、茎、叶、唇瓣以及5个不同发育时期种子为试验材料,12个候选内参基因在幼根、茎、叶和不同发育时期种子中均有表达,但表达量存在差异,在以全部样品为材料时,CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4表达稳定性好;PP2A3、TIF3I1基因在以不同组织为研究对象时表达最稳定;以不同发育时期种子为材料时TUBB3、UBC2基因表达最稳定。以UBC2和TUBB3基因及其组合基因为内参基因,检测目的基因ASK1和SERK2的相对表达量,来验证UBC2和TUBB3基因及其组合作为内参基因的可靠性。这些稳定的内参基因对于扇脉杓兰基因表达的定量分析具有重要参考价值。（3）本研究中,在5个样本中分别得到了1463543、5084343、8692446、2127279、1631381条Valid reads。大部分数据分布在20-24 nt,符合Dicer酶切割的典型特征。对这些数据进一步分析筛选出320个miRNA,其中已知的miRNAs有282个,分别属于miR166、miR156、miR159等58个保守的miRNA家族。在这58个miRNA家族中,成员最多的家族为miR159,共包括13个基因。这些miRNA的GO和KEGG富集分析显示,靶基因主要富集在生物学过程、转录调控、蛋白质磷酸化、胚胎发育信号转导等生物学过程和植物激素信号转导等途径。进一步对差异表达的miRNA进行趋势分析,将分析所得到的结果与转录组、降解组进行联合分析发现,miR156、miR171、miR160、miR166、miR168、miR390、miR5179家族的靶基因主要富集在生长素响应、编码蛋白等生物过程。这说明生长素响应、蛋白相关的基因在扇脉杓兰种胚发育过程中发挥重要作用。总体来讲,本研究以扇脉杓兰5个不同发育时期种子为试验对象,利用高通量测序技术研究了扇脉杓兰不同发育时期种子基因表达、miRNA表达以及靶基因,为揭示扇脉杓兰种胚发育过程中基因表达调控机理奠定了基础。