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1、研究背景目前乳腺癌是女性患病率和死亡率排名第一的恶性肿瘤。为保证治疗的有效性,乳腺癌患者通常需要面临更多日常挑战,如压力和焦虑等。慢性压力可导致交感神经系统过度兴奋,进而影响机体各稳态如内分泌、免疫和代谢等。大量文献报道证明,慢性压力能增强肿瘤增殖能力、提高肿瘤转移能力进而促进肿瘤的发生发展。慢性压力激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴,促进下游激素分泌增加,进而影响肿瘤的增殖、转移及复发等。由此靶向慢性压力及其分泌的激素,可为肿瘤患者治疗提供新思路。肿瘤细胞普遍存在的代谢异常现象,并且该现象已成为区别于正常细胞的重要标志之一。肿瘤细胞的代谢异常主要表现为,细胞在有氧条件下偏向于利用糖酵解为自身供能,这一现象被称为Warburgeffect。已有大量研究表明,有氧糖酵解会增加葡萄糖摄取和乳酸生成进而促进肿瘤生长和肿瘤化疗抵抗。乳酸脱氢酶A(LDHA)作为糖酵解反应的关键限速酶,将丙酮酸转化生成乳酸。有大量研究表明,LDHA在多种肿瘤内异常表达,抑制LDHA可有效降低恶性转化并延迟肿瘤形成,由此证明LDHA在肿瘤的发生发展中都有重要的作用。此外,LDHA可有效促进肝癌干性细胞的干性潜能并促进体外成球能力。由此提示,靶向癌细胞糖酵解,尤其是其关键代谢酶可为肿瘤患者治疗提供新希望。2、研究方法(1)(1)质谱实验检测PBS和肾上腺素(Epi)处理后的乳腺癌细胞的代谢产物变化水平;(2)使用海马仪器检测PBS和Epi处理后的细胞氧气消耗率及细胞外酸化率;(3)通过糖代谢相关试剂盒比较PBS和Epi处理后的细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量和ATP生成量。(2)(1)Westernblot实验比较PBS与Epi处理后乳腺癌细胞内糖代谢相关关键酶蛋白的表达差异;(2)利用低葡萄糖含量或高葡萄糖含量培养基培养乳腺癌细胞,检测下游关键糖代谢酶蛋白水平变化;(3)在乳腺癌细胞内敲降糖代谢关键蛋白后,检测干性相关因子蛋白水平表达变化;(4)LDHA活性抑制剂处理乳腺癌细胞,Western blot实验检测相关蛋白水平;(5)在乳腺癌培养基中外加乳酸,检测相关基因的蛋白变化。(3)(1)通过免疫组化实验检测乳腺癌患者肾上腺素分泌高低两组患者的LDHA蛋白表达量差异;(2)Westernblot实验检测乳腺癌患者癌与癌旁组织间LDHA蛋白表达差异;(3)Q-PCR检测贴壁培养与体外成球培养的乳腺癌细胞LDHA基因表达差异;(4)分析乳腺癌患者中肾上腺素分泌量与LDHA蛋白表达量与生成存期的相关性。(4)(1)利用稳定LDHA-GFP乳腺癌细胞株,检测与LDHA同时表达的GFP蛋白的荧光强度,筛选美国临床用药库内靶向LDHA的药物;(2)通过MTT实验检测靶向LDHA的药物的细胞毒性。(5)(1)通过Westernblot实验检测维生素C对肾上腺素的抑制作用,检测下游相关蛋白;(2)利用代谢相关试剂盒检测维生素C和肾上腺素处理后乳腺癌细胞乳酸产生量差异;(3)在NOD/SCID雌鼠皮下(每组6只)接种等量的乳腺癌细胞(1×10~6),培养30天后比较不同实验组小鼠肿瘤体积大小差异。3、研究结果(1)(1)质谱检测结果显示,Epi处理后的乳腺癌细胞糖代谢相关产物增多;(2)海马检测实验结果显示肾上腺素处理后的乳腺癌细胞氧气消耗量降低,细胞外酸化率增高;(3)糖代谢检测试剂盒结果显示肾上腺素提高乳腺癌细胞的葡萄糖摄取和乳酸产生但减少ATP生成。(2)(1)Westernblot结果显示肾上腺素促进乳腺癌细胞糖代谢关键酶及干性因子MYC的蛋白表达;(2)Westernblot结果显示高葡萄糖培养条件下乳腺癌细胞糖代谢关键酶蛋白表达量增高;(3)Westernblot结果显示,敲降LDHA可有效逆转肾上腺素对干性因子MYC的作用,然而敲降HK2不能逆转肾上腺素对干性因子MYC的作用;(4)Westernblot结果显示LDHA活性抑制剂可有效抑制乳腺癌细胞干性因子MYC的蛋白表达;(5)Westernblot结果显示乳酸可有效抑制乳腺癌细胞干性因子MYC的蛋白表达。(3)(1)免疫组化结果显示,肾上腺素含量高的乳腺癌患者LDHA蛋白表达高;(2)Westernblot结果显示乳腺癌患者中,LDHA蛋白表达量在癌组织中比癌旁组织中高;(3)Q-PCR结果显示体外成球培养的乳腺癌细胞LDHA基因表达增加。(4)乳腺癌患者生存期统计分析结果显示,肾上腺素高并且LDHA表达高的患者的生存期较肾上腺素低并且LDHA表达低的患者的生存期短。(4)(1)靶向LDHA的筛药体系的结果显示,有18种药物对LDHA有明显抑制作用,其中作用强并且稳定的是维生素C;(2)MTT结果显示,筛药时采用的药物浓度对细胞没有毒性。(5)(1)Westernblot结果显示,维生素C可以有效逆转肾上腺素对干性因子MYC的升高作用;(2)乳酸检测试剂盒结果显示维生素C可以有效逆转肾上腺素促进乳腺癌细胞乳酸产生的现象;(3)小鼠成瘤实验结果显示,敲降LDHA能够逆转慢性压力促进肿瘤生长的作用,同时维生素C也有相同的作用效果。4、研究结论(1)慢性压力产生的肾上腺素促进乳腺癌细胞的糖酵解;(2)慢性压力产生的肾上腺素促进LDHA表达;(3)慢性压力下的乳腺癌患者LDHA表达增高;(4)维生素C通过抑制LDHA逆转肾上腺素作用。