背景结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是位于全球癌症发病率第三位的一种消化系统恶性肿瘤,经典Wnt/β-catenin信号通路(经典Wnt通路)的异常激活是结肠癌发生的病理基础之一。低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Low density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)是经典Wnt通路信号转导的关键辅助受体,其表达水平与结直肠癌发生的关系仍不清楚,因此探究LRP5在CRC发生中的作用及其分子机制对于CRC的诊断和治疗具有重要意义。目的探究LRP5基因在结直肠癌发生中作用,有望从新的角度揭示CRC发生的分子机制,并为CRC的诊断及防治提供新的标志物和药物作用靶点。方法1.分析LRP5基因表达水平与CRC发生之间的关系(1)以不同肿瘤分级的CRC组织以及常用CRC细胞系Caco2、HCT-116、LoVo和SW480为研究对象,使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,RT-PCR)和免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)等技术分析LRP5表达水平的差异。(2)挖掘Oncomine和TCGA等数据库,分析结直肠癌组织和正常组织中LRP5基因的mRNA水平差异,确定LRP5基因表达水平与患者生存时间、肿瘤分期与分级等临床指标之间的相关性。同时通过Human Protein Atlas数据库,挖掘结直肠癌组织和正常组织中LRP5蛋白表达水平的相关数据。2.构建稳定激活或抑制LRP5基因表达的CRC细胞系(1)构建激活或抑制LRP5基因的CRC细胞系:对CRC细胞系HCT-116转染特异性靶向抑制LRP5基因的CRISPR/Cas9 KO质粒或激活LRP5基因表达的CRISPR质粒。嘌呤霉素筛选,通过RT-PCR分析鉴定LRP5基因mRNA水平的变化情况。(2)筛选稳定激活或抑制LRP5基因的CRC单克隆细胞系:流式细胞仪将激活或抑制LRP5基因的杂合CRC细胞分选至96孔细胞培养板并扩大培养。RT-PCR和Western blot鉴定,以LRP5基因上调或下调最为明显的细胞株作为稳定激活或抑制LRP5表达的单克隆细胞株。3.细胞和动物水平上鉴定激活LRP5基因表达对CRC的进展及其分子机制影响(1)选取稳定激活LRP5基因的CRC单克隆细胞系及其阴性对照细胞,考察激活LRP5基因的表达能力对细胞恶性表型以及裸鼠体内移植瘤形成能力的影响。给予顺铂处理,检测CRC细胞凋亡情况的变化。(2)激活LRP5基因表达后CRC细胞内经典Wnt通路关键基因的变化。(3)检测激活LRP5基因表达后CRC细胞内IL-6/STAT3通路关键基因分子水平上的变化。(4)检测激活LRP5基因表达后CRC细胞内肿瘤干性标记分子和肿瘤干性相关基因的变化。(5)分析结直肠癌肿瘤干细胞中经典Wnt通路及IL-6/STAT3通路相关基因的表达以肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)表面特异性标记分子CD133作为分选标记,将CRC细胞分成CD133+、CD133-两群细胞,检测其中经典Wnt通路及IL-6/STAT3通路相关基因的表达情况。同时结合肿瘤数据挖掘,分析CD133+、CD133-标记的其他CRC细胞系中LRP5表达水平的差异,以及LRP5、CD133和STAT3表达水平之间的相关性。4.鉴定敲除内源性LRP5基因对CRC的进展及其分子机制影响(1)选取LRP5基因表达明显降低的CRC细胞系及其阴性对照细胞,考察抑制内源性LRP5基因表达对细胞恶性表型以及裸鼠体内移植瘤形成能力的影响。(2)检测抑制内源性LRP5基因表达后CRC细胞内经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路关键基因mRNA和蛋白水平的变化情况。检测顺铂处理后相关凋亡基因的变化情况。(3)检测抑制内源性LRP5基因表达后CRC细胞内肿瘤干性关键基因表达水平的变化情况。结果1.LRP5基因表达水平与CRC发生之间的相关性分析RT-PCR和IHC结果显示:与正常组织对比,CRC组织中LRP5基因的表达水平升高。肿瘤分级、TNM分期等与LRP5基因表达水平的相关性结果显示,LRP5基因的表达水平与CRC的恶性进展程度呈明显正相关。2.成功构建稳定激活或抑制LRP5基因表达的CRC细胞系RT-PCR和Western bolt结果显示:稳定激活或敲低LRP5基因表达的CRC稳转单克隆细胞系构建成功。3.激活或抑制LRP5基因能够促进或抑制CRC的恶性表型(1)实时无标记细胞分析技术(Real time cellular analysis,RTCA)检测结果:激活LRP5基因表达增强CRC稳转细胞系的细胞增殖速度。反之,敲除内源性LRP5基因抑制CRC细胞的增殖速度。(2)细胞划痕结果:激活LRP5基因表达后CRC细胞的划痕愈合速率增加,抑制LRP5基因表达降低CRC细胞的划痕愈合速率。(3)集落克隆实验结果:激活LRP5基因表达后,细胞集落克隆形成的数目增多;反之,抑制LRP5基因表达后细胞集落克隆形成数目减少。(4)细胞瘤球实验结果显示:激活LRP5基因表达后,CRC细胞形成的瘤球体积增大;相反,抑制LRP5基因表达后,CRC细胞形成的瘤球数目减少、体积变小,提示抑制LRP5基因表达会降低肿瘤细胞的干性。(5)顺铂敏感性结果:激活LRP5基因后HCT-116细胞对化疗药物的敏感性降低;相反,抑制LRP5基因表达会提高HCT-116细胞对化疗药物的敏感性。(6)裸鼠成瘤实验:激活LRP5基因能够促进CRC细胞在裸鼠体内的成瘤速度,抑制LRP5基因表达会可抑制CRC细胞在裸鼠体内的成瘤速度。4.激活或抑制LRP5基因促进或抑制CRC进展的机制研究(1)激活LRP5基因后HCT-116细胞内经典Wnt通路关键基因CTNNB1、c-Myc、CCND1和COX2等的mRNA水平上调。抑制LRP5基因表达后,上述经典Wnt信号通路关键基因的mRNA表达水平下调。(2)激活LRP5基因后HCT-116细胞内肿瘤干细胞干性标记分子和干性相关基因CDI33、ALDH1A1、Bmil、Oct3/4和Nanog的mRNA水平升高。抑制LRP5基因表达后HCT-116细胞内上述基因表达水平下降。(3)生物信息学数据分析显示LRP5表达水平与CD133的表达水平呈正相关。(4)以肿瘤干细胞表面特异标记分子CD133为标记,流式分选出CD133+、CD133-的HCT-116细胞群,CD133+细胞群中目标基因LRP5表达水平上调,并且经典Wnt通路关键基因的mRNA水平也明显升高。(5)在CD133+细胞群中IL-6和STAT3基因的表达水平也明显上调。(6)RT-PCR和Western blot结果显示:激活LRP5基因后HCT-116细胞内IL-6和STAT3的表达水平上调,抑制LRP5表达会降低HCT-116细胞中IL-6和STAT3基因的表达水平。(7)生物信息学数据分析显示LRP5基因的mRNA水平与STAT3基因的mRNA水平呈明显正相关,CD133基因的mRNA水平与STAT3基因的mRNA水平呈明显正相关。结论1.LRP5基因在CRC组织和细胞系中的表达水平明显上调,此发现为CRC临床诊断提供了一个潜在的诊断标志物。2.激活LRP5基因通过激活经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路增强CRC细胞的干性特征,降低其对化疗药物的敏感性,促进CRC的发生和发展。3.抑制LRP5基因通过抑制经典Wnt通路和IL-6/STAT3通路抑制CRC细胞的干性,增强其对化疗药物的敏感性,抑制CRC的发生和发展。4.本课题的顺利实施,从一个全新的角度揭示CRC发生的机制,LRP5基因有望为CRC的诊断及防治提供新的标志物和药物作用靶点。