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深静脉血栓形成（DVT）是骨科大手术后常见并发症,其发病率高,早期预测诊断困难,严重影响患者的生活质量。DVT发病机制复杂,涉及静脉内皮细胞激活、炎症反应以及凝血/抗凝系统失衡等诸多过程,其中静脉内皮细胞中Klfs、Mmps、IL、TF等基因调控与血栓形成密切相关。课题组前期通过RNA-seq检测正常组和DVT造模组小鼠下腔静脉组织,发现Mmp13在DVT组表达上调。另外尾静脉注射siRNA干扰Klf15表达后静脉内皮细胞中Mmp13表达上调,血栓湿重增加,提示Klf15可能调控下游Mmp13的表达,进而影响血栓形成。本课题就Mmp13在Klf15基因敲除纯合子小鼠DVT模型中的表达变化及其作用进行实验研究,进一步验证Klf15对Mmp13表达的影响。[目 的]1、利用染色质免疫共沉淀测序技术筛选KLF15调控的靶基因。2、通过观察野生型和Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠DVT模型中血栓形成情况及下腔静脉内皮细胞Mmp13表达变化,明确Mmp13是否对深静脉血栓的形成起作用,进一步验证Klf 15是否通过调控Mmp13的表达影响血栓形成。[方 法]第一部分:染色质免疫共沉淀测序技术筛选KLF15调控的靶基因通过构建KLF15过表达质粒转染HUVECs,利用ChIP富集KLF15在HUVECs中结合的靶基因,结合高通量测序技术,在全基因组范畴内分析与KLF15特异结合的DNA位点情况,并对差异基因进行GO和KEGG分析。第二部分:狭窄法构建Klf15基因敲除纯合子小鼠DVT模型,尾静脉注射siRNA干扰小鼠Mmp13表达,分析Mmp13在小鼠DVT模型中的表达变化及其作用。1、实验一选取野生型C57BL/6小鼠20只,随机分为Blank-WT组（n=10）和DVT-WT组（n=10）。选取鉴定成功的Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠10只,随机分为Blank-K0组（n=5）和DVT-K组（n=5）。以上小鼠均于SPF级饲养,雌雄不限,体重为25～26g。DVT-WT和DVT-KO两组均行下腔静脉狭窄法构建血栓模型,术后24小时取出血栓及对应区段静脉内皮组织,观察并测量各组血栓湿重、长度,计算成栓率等指标,Q-PCR检测小鼠静脉内皮细胞Mmp13表达情况。2、实验二选取野生型C57BL/6小鼠12只,随机分为NC-WT组（n=6）和Mfmp13-siRNA-WT组（n=6）。选取鉴定成功的Klf15基因敲除纯合子C57BL/6小鼠12只,随机分为NC-K0组（n=6）和Mmp13-siRNA-K0组（n=6）。以上小鼠均于SPF级饲养,雌雄不限,体重约25～26g。其中NC-WT组和NC-K0组造模前24小时尾静脉注射生理盐水200 μl/只,Mmp13-siRNA-WT组和Mmp13-siRNA-K0组尾静脉注射Mmp13-siRNA 200 μl/只。造模24小时后取出血栓及对应区段静脉内皮组织,观察并测量各组血栓湿重、长度,计算成栓率等指标,Q-PCR检测小鼠静脉内皮细胞中Mmp13表达情况。运用RNA测序技术检测NC-WT组和Mmp13-siRNA-WT组静脉内皮组织中差异性基因表达情况,并进行G0和KEGG分析,研究其对血栓形成的影响。3、采用GraphPad Prism 7软件分析实验数据,综合分析Mmp13对深静脉血栓形成的作用,验证Klf15与Mmp13之间的调控关系。[结 果]第一部分结果成功构建pLVX-mCMV-ZsGreen1-Puro-DX-KLF15过表达质粒,染色质免疫共沉淀测序发现大量KLF15靶基因选择性地富集在KLF15过表达的HUVECs中,并参与多种信号通路。第二部分结果实验一结果:1、小鼠存活及成栓率:Blank-WT组和Blank-K0组均未造模,未见小鼠死亡,死亡率为0,成栓率为0;DVT-WT组小鼠死亡1只,死亡率为10%,成栓率为77.77%;DVT-K0组小鼠死亡1只,死亡率为20%,成栓率为75%。2、小鼠血栓湿重:Blank-WT组和Blank-KO组均未见血栓形成;DVT-WT组血栓湿重为 16.50±3.68mg,DVT-K0 组血栓湿重为 24.70±4.69mg。与 DVT-WT组相比,DVT-K0组血栓湿重显著增加（P<0.05）。3、小鼠下腔静脉内皮细胞Mmp13表达情况:Q-PCR检测各组静脉内皮细胞Mmp13表达变化,与Blank-WT组相比较,DVT-WT组Mmp13表达明显增加（P<0.05）。与DVT-WT组相比较,DVT-KO组Mmp13表达明显增加（P<0.05）。实验二结果:1、尾静脉注射情况:四组均进行尾静脉注射,NC-WT组和Mmp13-siRNA-K0组尾静脉注射成功均为5只,成功率为83.3%;Mmp13-siRNA-WT组和NC-K0组尾静脉全部注射成功,成功率为100%。2、小鼠存活及成栓率:各组小鼠均采用下腔静脉狭窄法构建DVT模型。NC-WT组小鼠死亡0只,死亡率为0,成栓率为100%;Mmp13-siRNA-WT组小鼠死亡1只,死亡率为16.6%,成栓率为83.3%;NC-K0组小鼠死亡1只,死亡率为16.6%,成栓率为66.7%;Mmp13-siRNA-K0组小鼠死亡0只,死亡率为0,成栓率为80%。3、小鼠下腔静脉血栓湿重:NC-WT组、Mmp13-siRNA-WT组、NC-KO组和Mmp13-siRNA-K0组血栓湿重分别为17.60±1.01mg、9.02±2.16mg、25.13±1.18mg 和 13.83±2.31mg。与 NC-WT 组相比,Mmp13-siRNA-WT 组血栓湿重明显减轻（P<0.05）。与NC-KO组相比,Mmp13-siRNA-K0组血栓湿重减轻（P<0.05）。4、小鼠下腔静脉内皮细胞Mmp13表达情况:与NC组相比,Mmp13-siRNA组尾静脉注射Mmp13-siRNA干扰后静脉内皮细胞Mmp13表达明显减低（P<0.05）。5、RNA-seq结果:Mmp13-siRNA-WT组和NC-WT组比较组合中共鉴定出差异性表达基因1855个,表达上调的差异基因有932个,表达下调的差异基因有923个（|log2（FoldChange）|>2,padj<0.05）。筛选出与血栓形成相关的差异表达基因Nlrp3,IL-1 β,Cxcr2,Cxc12等可能通过炎症反应和免疫调节影响血栓形成。[结 论]1、小鼠DVT模型静脉内皮细胞中Mmp13促进血栓形成。2、Mmp13可能通过调节Nlrp3,IL-1β,Cxcr2,Cxc12等影响血栓形成。3、Klf15可能通过调控Mmp13的表达影响血栓形成。