研究背景与目的母体产道中的脱落胎儿细胞由于含有完整的细胞结构以及胎儿的整套基因组信息,而在非整倍体疾病、染色体微缺失、单基因性疾病以及新生儿溶血病等遗传性疾病的无创产前诊断中发挥着重要的作用。然而,脱落胎儿细胞的分离与鉴定仍缺乏快速、有效的检测方法;此外,目前尚缺乏对这些稀有细胞进行充分的胎源性验证;另外,目前这些稀有胎儿细胞在单基因性疾病的产前诊断应用仍需探究。因此,在本课题中,我们将建立一种快速、简便、有效的方法,用于脱落滋养层细胞的鉴定与分离;同时,我们将单细胞分离的胎儿细胞进行深入的、多位点的胎源性验证;在第三部分中,我们还将这些稀有细胞运用于地中海贫血的产前诊断中,并通过高通量测序分析,从而评估其在地中海贫血等单基因性疾病中的应用。研究方法1.通过ddPCR与qPCR评估脱落胎儿细胞的数目;通过显微镜荧光定量与流式细胞术等评估滋养层细胞与母体细胞差异,建立脱落滋养层细胞新型鉴定方法（内质网染色结合线性判别分析,ER-LDA）;评估ER-LDA在细胞系模型与临床标本中的检测效果。2.通过单细胞分离,获取滋养层单细胞;通过免疫荧光分析脱落滋养层细胞的蛋白标志物表达情况;通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、短串联重复序列（short tandem repeat,STR）与单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分析,验证这些稀有细胞的胎源性。3.收集多个α地中海贫血与β地中海贫血孕妇病例样本,利用稀有滋养层细胞对相应的突变位点进行检测与分析;qPCR检测母体DNA与稀有滋养层细胞RHD分型,评估其用于新生儿溶血病产前检测的可能性;稀有滋养层细胞进行全外显子测序（whole exome sequencing,WES）分析,评估其在检测其他单基因性疾病致病位点中的可行性。实验结果1.脱落滋养层细胞个数约为72-5150个;内质网染色后滋养层细胞的荧光强度约为鳞状上皮细胞的3.13±1.13倍,为白细胞的2.64±0.73倍;通过ER-LDA分析,可在细胞模型中获取敏感性为99.0%、特异性为98.75%、准确性为98.83%的滋养层细胞的鉴别能力;另外,通过ER-LDA获取的单细胞基因组扩增覆盖度良好。2.通过ER-LDA分离临床标本中的滋养层细胞具有多个共同特征;均为HLA-G表达阳性或β-hCG阳性;FISH以及SRY-PCR检测候选男胎细胞可观察到Y染色体阳性信号;19个STR与22个SNP位点分析表明这些稀有细胞为胎儿来源性。3.稀有胎儿细胞可成功用于--SEA地中海贫血、-α4.2地中海贫血、多种β地中海贫血类型的突变检测,其检测结果与有创穿刺检测结果一致;通过稀有胎儿细胞RHD基因分型推测的RHD型别与血清型结果一致;稀有滋养层细胞WES分析可获取大量与疾病相关的变异位点,表明其可用于其他单基因性疾病突变位点的筛查与检测。结论我们成功地建立了一种新的、快速、有效的滋养层细胞鉴定方法,通过单细胞分离获取的稀有滋养层细胞具有完整的胎儿基因组,可用于多种地中海贫血亚型的产前诊断、RHD基因分型以及其他单基因性疾病的产前诊断。