胶原（Collagen）是骨的重要组成成分,正常骨组织中胶原含量约达20%,胶原蛋白是具有三重螺旋结构的纤维状蛋白,不溶于水,在体内环境下,胶原成分稳定,参与构成细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）并且是细胞外基质中最重要的纤维蛋白。胶原所形成的半晶体状纤维稳定存在于细胞外基质中,作为骨架结构,为细胞的结构提供必要的抗张力和一定的弹性支持,并能在细胞迁移、增殖和分化的全过程中发挥重要的作用。I型胶原（Collagen type I,COL-I）是骨细胞外基质的主要组成部分,对骨细胞功能行使和维持有重要作用,在近数十年来兴起的组织工程与再生医学研究和应用中,I型胶原是最为常用的天然来源骨组织工程支架,具有疏松多孔结构以及良好的渗透性和亲水性,也是诸如成骨细胞、成纤维细胞的理想支架材料,利于细胞附着,并可促进其进一步生长、分化,植入体内后,可逐步转化为正常组织。I型胶原常以海绵、细胞膜片或凝胶等形式用于组织工程中,其强度很低,植入体内会很快降解吸收,在较大范围骨缺损修复、或需要有负载能力的植骨材料时,单纯胶原难以达到要求,要使人工骨再生及骨生物重建成为可能,根据颌面部骨骼形态结构和功能成分构建组织工程核心环节的生物材料就要有更高的要求。本课题组前期研究中,采用自固化磷酸钙（Calcium phosphate cement,CPC）模拟天然骨无机成分构建组织工程骨替代材料,其最大优势主要在于它具有足够的负载强度,能够作为一种支撑材料承受一定的压力,并且在形态学方面,CPC固化前可塑性较强,可以任意塑形填充不规则骨缺损;同时,CPC还具有骨引导活性,生物相容性与安全性俱佳,是一种可承载生物活性分子的理想无机载体。但其缺点也较为突出,在成骨方面,CPC尚缺乏骨诱导活性,不能自行成骨;生物活性方面,CPC在机体内的降解速度常无法与正常骨组织的新陈代谢同步。为了解决上述无机材料的相关问题,我们根据仿生医学研究技术,选择胶原构建不同组合模式的胶原-CPC复合材料,利用胶原的渗透性、亲水性,提高复合组织工程支架材料的孔隙率和孔隙直径,并参与构成细胞外基质,对其的生物力学等理化性能进行体外测试,对其生物学特性通过体内组织学研究进行探索,望能够明确胶原用于构建CPC为基础的骨再生复合材料支架的有效方式,复合材料在体内向成骨方向转化。目前用于基础研究使用的胶原材料多为异种动物来源,在材料处理方面存在保存生物活性与消除组织抗原性和病原性之间的矛盾,常导致成骨能力不稳定,是限制其临床应用特别是大型复杂骨缺损修复应用的主要原因。如何获取具有更好活性和安全性的同种人源性胶原或类胶原材料,成为我们研究的一个重要方向。在课题组前期研究基础上,我们提出以自组装类胶原多肽RAD16-I和生物活性因子神经递质多肽小分子P物质（Substance P,SP）来构建新型复合水凝胶支架材料,使用人脐带组织来源的间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stromal cells,hUCMSCs）作为种子细胞,构建类胶原-干细胞复合物,通过神经递质多肽P物质诱导成骨的生物活性,体外长时间立体诱导培养干细胞,观察RAD16-I/SP/hUCMSCs复合体的生物学特征、成骨分化表型、组织学结构等,初步探索体外人工构建人源性类胶原活性复合体替代动物源性I型胶原的可行性。第一部分:胶原改善自固化磷酸钙材料生物活性的可行方法目的:探索胶原作为有机成分改善磷酸钙材料成骨生物活性并构建人工支架材料的可行方法。方法:制备鼠尾I型胶原蛋白（COL-I）冻干海绵以及神经多肽递质P物质（SP）溶液,与自固化磷酸钙（CPC）粉末构建单纯CPC组（A组）作为对照组、CPC/SP组（B组）、CPC/COL-I组（C组）和CPC/SP/COL-I组（D组）作为实验组共4组不同模式的CPC及其复合材料,并通过XRD、SEM等检测方法对各组材料就固化时间、物相成分、超微结构、力学性能等方面进行体外检测分析;根据前期实验结果,选择CPC/SP/COL-I复合材料作为实验材料,单纯CPC作为对照材料,辅助种植体植入兔股骨骨缺损,8周后观察种植体骨结合情况。结果:C组、D组复合材料的初始固化时间与终末固化时间与A组、B组相比均有所延长,且初始固化时间A组、B组分别与C组、D组存在统计学差异（P<0.05）。CPC及其复合材料支架的XRD分析示,加入COL-I和SP未改变CPC的物相成分和主体结构,也未引入其他无机物成分。结合复合材料的扫描电镜观察,在引入COL-I材料混合前,CPC固化后颗粒之间的孔径较小,约为10-15μm,但在复合COL-I后由于材料的结构排列及结合方式改变,增大了材料的孔隙直径至70μm。通过对各组复合材料的压缩强度和弹性模量测定研究发现,在复合材料完全固化并充分干燥后,C组、D组的压缩强度较A组、B组略有降低,但各组之间压缩强度对比无统计学差异（P>0.05）。通过COL-I材料的复合,C组、D组复合材料的弹性模量分别较A组、B组有所降低,结果具有统计学差异（P<0.05）。动物实验硬组织标本切片染色结果示,单纯CPC组中种植体周围材料未完全降解,骨缺损区未见明显新骨生成;CPC复合材料组可见材料已完全降解,并被较为成熟的骨小梁替代,种植体形成骨结合愈合,骨缺损区消失。结论:复合胶原的CPC材料具有更为理想的微观孔隙形态和直径,并可以在一定程度上模拟松质骨的生物力学和形态结构特征,胶原和活性多肽SP的加入对CPC的物相构成、晶体结构未产生明显影响,可以有效改善CPC材料的生物活性与降解速率,在体内能够于较短的时间内诱导引导新骨再生,是一种构建活性成骨支架材料的可行方法。第二部分:采用自组装多肽复合hUCMSCs构建类骨胶原基质的研究目的:利用自组装多肽RAD16-I复合SP多肽并接种hUCMSCs进行体外立体培养,观察复合体向骨胶原转化的表现,探索体外构建人源性可注射类胶原活性基质的可行性。方法:采用酶消化法获取人脐带组织沃顿胶内的间充质干细胞并对细胞表面标识分子进行免疫荧光及流式细胞术鉴定;对hUCMSCs进行成骨向和成脂向分化诱导,使用茜素红和油红O染色观察细胞分化情况。将hUCMSCs分别进行平面培养（2D培养组）与立体培养（3D培养组）,加入完全培养基的平面培养组标记为Control组作为对照,加入含有1×10^-8M SP完全培养基的平面培养组标记为SP组;利用自组装类胶原多肽RAD16-I构建一种类骨胶原基质环境进行三维立体培养组标记为RAD16-I组,加入含有1×10^-8M SP完全培养基的立体培养组标记为RAD16-I/SP组;以上4组分别培养1-4w,对各组进行细胞增殖、细胞活力、成骨相关基因表达测定、组织学特征观察、可注射性等相关研究,以注射方式将自组装多肽-干细胞复合物与CPC混合,观察复合材料超微结构及hUCMSCs生长情况。结果:通过原代培养得到的人脐带间充质干细胞,细胞形态为长梭形,生长状态良好,经免疫荧光测定细胞纯度达90%以上,流式细胞仪检测鉴定干细胞表面抗原标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105表达阳性,造血细胞标记物CD34、CD45、CD106表达阴性,鉴定为hUCMSCs。hUCMSCs成脂诱导培养4w后镜下观察实验组形成明显脂滴,对照组无明显脂滴形成;hUCMSCs成骨诱导培养4w后镜下观察实验组形成矿化结节,对照组无明显矿化结节形成。倒置显微镜40倍镜下观察类骨胶原基质内培养的hUCMSCs,立体培养组细胞接种后早期呈团装聚集,随后逐渐伸展,细胞逐渐增多,呈长梭形或不规则多边形。CCK-8法细胞增殖测定各组细胞在1d、2d、3d、5d、7d的OD值进行对比发现,空白对照组的细胞增殖率在各时间点最低,各组细胞均在3-5d呈对数增长,7d时其余三组细胞增殖情况优于空白对照组,且具有统计学差异（P<0.05）,三组组间未见统计学差异。活/死细胞荧光染色结果显示1-7d时各组细胞普遍呈现绿染,表明多数为活细胞,且细胞数量逐渐增多,细胞形态逐渐伸展,呈长梭形或者不规则多边形,仅极少量细胞红染,活细胞百分比始终处于较高的状态。实时定量PCR结果显示,hUCMSCs连续培养4w时,平面培养SP组与立体培养SP/RAD16-I组的成骨相关基因ALP、OCN、RUNX-2、COL-1表达均显著高于其余2组。培养4w后立体培养组及含SP的平面培养组茜素红染色有矿化表现。组织学观察立体培养组细胞呈团块状聚集,细胞周围具有类骨胶原基质环境,相较于平面培养组细胞体积面积更大。立体培养组中的细胞-类胶原基质复合体经注射后活细胞数量占90%以上;与CPC复合固化后,材料具有与实验一获得材料相似的微观孔隙形态结构,并且细胞可紧密黏附于复合材料中,生成状态良好。结论:采用I型胶原酶消化法可成功从人脐带组织获得hUCMSCs,经成骨诱导液及成脂诱导液进行细胞多向诱导分化培养证实hUCMSCs具有多向分化功能和潜力。hUCMSCs能够在由自组装类胶原多肽构建的类骨胶原基质立体培养系统内稳定地生长、增殖和迁移并较传统二维平面培养更加活跃和高效,成骨标志基因表达水平也较平面培养组更高。RAD16-I多肽作为立体培养/移植系统能与SP多肽组合,共同促进种子干细胞的生长、增殖及分化,共同构建保持活性状态的类胶原基质,并具有可注射性和自组装性,RAD16-I/SP/hUCMSCs组合可作为再生医学中应用于临床前期研究的类胶原组织工程材料。