乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf）是哺乳动物乳汁中含量丰富的一种铁结合糖蛋白,目前已发现乳铁蛋白及其水解产物具有广谱抗菌,抗氧化,抗病毒,调节免疫反应,促进铁吸收等多种生理功能,是哺乳动物体内非特异性免疫防御系统的重要组成成分之一。本实验通过基因工程手段,构建真核重组表达载体,实现牛乳铁蛋白N-叶（1-333个氨基酸）在巴斯德毕赤酵母中的异源表达,并对其功能活性进行测定。采用实验室规模5L发酵罐水平进行发酵小试,为深入研究乳铁蛋白的结构和功能,进一步实现规模化工业生产提供实践基础和理论指导。本实验人工合成密码子优化改造的牛乳铁蛋白N-叶基因序列,在不改变氨基酸编码序列前提下,在充分考虑GC含量,起始密码子处的二级结构及自由能的基础上选择巴斯德毕赤酵母偏爱密码子,并消除mRNA降解信号和内部转录终止序列,去掉N-叶自身的信号肽编码序列,利用pPIC9K所携带的α信号肽进行分泌表达。优化后共改变253个碱基,C+G含量由56.39%降至40.42%;起始密码子附近mRNA二级结构减少,自由能明显降低,有利于维持mRNA的稳定性,促进翻译顺利进行,有助于提高目的蛋白表达量。进一步构建了牛乳铁蛋白N-叶毕赤酵母表达载体pPICPK-BLfN-6His,Pme I线性化后电转化入毕赤酵母GS115中,在0.5%甲醇条件下摇瓶水平诱导表达,Endo H对发酵液上清进行去糖基化处理,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白得到表达并进行了糖基化修饰,其分子量约为38 kDa,并在摇瓶水平进行pH和溶氧条件优化。将摇瓶水平筛选到的高表达量重组子进行实验室规模5L发酵罐水平高密度发酵,在优化碳源,pH,补料添加策略的基础上,诱导96h后,发酵液上清中总蛋白量达到540.07 mg/L。采用His-bind镍柱亲和层析分离纯化目的蛋白,并对其铁结合功能和抑菌功能进行实验测定。rBLfN具有pH依赖性的Fe3+释放能力,随着pH下降,与铁结合能力逐渐降低。体外抑制Staphylococcus aureus ATCC 25923,与阴性对照1.12×107 CFUs/ml相比,浓度为6 mg/ml和3 mg/ml rBLfN对Staphylococcus aureus ATCC 25923的（生长有抑制作用,）MIC分别为0.68×107 CFUs/ml和0.92×107 CFUs/ml。