研究背景和目的:巨噬细胞（Mφ）对机体天然免疫和适应性免疫均具有重要的调节作用,在炎症相关肿瘤的发生发展中具有重要功能。肿瘤中浸润的Mφ称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,其在肿瘤细胞的生长、存活和转移过程中发挥重要作用。研究发现TAM能够通过产生高水平的IL-6促进肝癌干细胞增殖;RNA聚合酶Ⅱ第五亚基调节蛋白（RMP）在肝癌细胞中呈较高水平表达,其可通过影响炎症因子IL-6的转录,从而对肝癌起始细胞发挥调控功能。本课题组前期研究发现,Mφ激活时,其胞内RMP表达下降;抑制/敲除Mφ内RMP表达也可显著增强炎性因子刺激下的Mφ活化。因此,本研究组推测RMP可能通过调控Mφ功能参与肝癌的发生发展。本课题拟深入研究RMP对Mφ天然免疫活化的影响,并应用RMP条件性敲除小鼠和体内荷瘤肝癌模型,探讨RMP通过调控Mφ功能参与肝癌发生发展的可能的分子机制,为认识炎症和肿瘤发生及进展的关系提供理论证据。实验方法:1、RMP髓系细胞条件性敲除小鼠构建:构建打靶载体,经电穿孔转移DNA入胚胎干细胞（ES）,体外培养的ES细胞囊胚注射入假孕鼠体内,经自然分娩产下后代即为嵌合小鼠。挑选毛色嵌合率大于50%的雄性鼠与C57BL/6J纯系小鼠交配即获得ES细胞来源的小鼠。用RT-PCR和蛋白免疫印迹法鉴定阳性杂合子小鼠。2、给小鼠注射细菌脂多糖（LPS）诱导内毒素休克实验,H&E染色分析肺损伤情况,酶联免疫法（ELISA）检测相应小鼠血清中的炎症细胞因子释放情况,流式细胞仪检测小鼠腹腔浸润细胞,评估RMP在单核/巨噬细胞中的功能。3、分离和培养了原代腹腔巨噬细胞Mφ和骨髓来源巨噬细胞BMDM,免疫印迹法检测LPS刺激后NF-κB和MAPK信号通路的激活程度。RT-PCR法和ELISA法检测上述两种细胞在LPS和TNFα刺激下炎症细胞因子的释放水平。4、在单核/巨噬细胞系中,使用质粒转染使RMP过表达,并采用慢病毒介导的shRNA方法干扰巨噬细胞系内RMP的表达。在上述RMP高/低表达模型中,使用LPS刺激后,免疫印迹法检测NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平,RT-PCR法检测下游炎症细胞因子的mRNA水平,ELISA检测细胞培养基中下游炎症细胞因子的蛋白浓度。5、使用LPS或TNFα刺激RAW 264.7细胞后,免疫印迹法检测RMP和下游信号通路变化情况,质谱分析鉴定RMP磷酸化位点;通过特定激酶的抑制实验,探索导致小鼠RMP磷酸化的可能激酶;体外蛋白质免疫共沉淀法验证相应的互作蛋白。6、应用二乙基亚硝胺（DEN）原发性诱癌模型中评估RMP对诱癌小鼠的影响;应用裸鼠皮下荷瘤和敲除RMP小鼠皮下种植小鼠肝癌细胞方法检测肿瘤生长情况,评价特异性RMP敲除巨噬细胞对肿瘤生长情况的影响。结果:1、成功建立RMPfloxp/floxp小鼠,经与Lyz2-CRE小鼠杂交获得髓系特异性RMP敲除小鼠。2、致死剂量LPS内毒素休克模型观察髓系特异性RMP敲除对小鼠炎症及生存时间的影响。结果显示,与野生型小鼠相比,RMP髓系敲除小鼠肺组织损伤加重,腹腔浸润细胞显著增多;血清中TNFα和IL-1β的表达量分别为对照组的1.8倍和1.6倍（分别为p=0.007和p=0.024）;且RMP小鼠的生存时间明显缩短（26.7小时vs 32.6小时,p=0.041）。表明单核/巨噬细胞中敲除RMP加剧了 LPS诱导的急性损伤,对LPS的刺激有放大效应,促进了炎症反应的扩大和升级。3、RMP敲除能够促进巨噬细胞合成、分泌炎症因子,增强巨噬细胞对LPS和TNFα刺激的反应性,促进NF-κB和MAPK信号通路的激活。4、过表达RMP显著抑制巨噬细胞活化和炎症因子的合成与分泌。5、RMP能够抑制调控巨噬细胞向肿瘤细胞迁移。6、巨噬细胞活化伴随着RMP磷酸化,PKC和IKK抑制剂可以抑制RMP磷酸化水平。7、蛋白质免疫共沉淀结果显示RMP能够与IKKβ相互作用。8、DEN诱癌模型发现,髓系特异性RMP敲除组小鼠肿瘤数目为对照组的3.6倍（p<0.001）,且体积更大;且RMP特异性敲除组小鼠的存活时间比未敲除组更短（35.4周vs 46.7周,p=0.037）。小鼠肝癌细胞系Hep1-6在RMP髓系敲除小鼠体内生长显著快于野生型小鼠。提示单核/巨噬细胞中特异性敲除RMP可以促进肝癌的发生、发展。结论:本文通过对巨噬细胞内RMP参与肝细胞癌发生及其具体分子机制的研究发现:1、RMP可被磷酸化,且IKKβ是其激酶。2、巨噬细胞内RMP通过NF-κB和MAPKs信号通路负性调控巨噬细胞功能,改变肿瘤炎症微环境,参与原发性肝细胞癌的发生与发展。3、通过对巨噬细胞内RMP功能的研究,发现了 RMP参与原发性肝细胞癌的新型分子机理。本研究结果为以RMP作为分子靶标开发肝癌的免疫治疗提供新的思路。