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目的
乳腺癌是严重威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤之一，随着精准医学的发展，分子靶向治疗已成为继手术、放疗、化疗后的一种极具前途的治疗方式，寻找乳腺癌有效的治疗靶点进行相应的靶向治疗已成为当前乳腺癌相关研究的热点之一。分子靶向治疗是以肿瘤细胞内特异的标志性分子为靶点,进行有效干预，从而抑制肿瘤生长和转移,并进行有效治疗。所以，寻找有效的肿瘤分子标志物是当前的主要任务。
miRNA是一类长度为18-25个核苷酸(nucleotide, nt)平均长度约为22nt左右的内源性非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、细菌等多种有机体中，并在动植物的生长发育，疾病的发生、发展及治疗预后等方面起着重要作用。研究发现，miRNA在多种肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用，它主要通过与靶mRNA3’UTR的完全或不完全配对，下调靶标基因或抑制其翻译，在转录后的水平上影响细胞的分化、繁殖、转移、凋亡等多种病理生理过程。lncRNA是一类转录本长度超过200nt且不能够翻译蛋白的功能性分子，它能够在多种层面上调控基因的表达水平，即影响基因的表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达等多个方面，广泛参与机体几乎所有生理和病理过程。越来越多的证据表明，miRNA和lncRNA的异常表达可能在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的作用，而且他们之间存在着复杂的交互作用。
本研究利用基因芯片技术筛选乳腺癌组织与正常对照组织、乳腺癌血液与正常对照血液标本差异表达的miRNA和lncRNA，筛选出具有明显表达差异的乳腺癌相关的miRNA和lncRNA基因。对筛选出的乳腺癌差异性表达的miRNA和lncRNA采用快速、敏感性高和特异性强的实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction qRT-PCR)检测，进行方法学评价及乳腺癌临床应用性能评价。筛选出的乳腺癌相关的miRNA和lncRNA，作为血液肿瘤分子标志物用于临床，对乳腺癌早期无创诊断、个体化治疗、疗效观察、预后判断等诸多方面的临床意义进行研究。探讨利用一组特征性血液miRNA和lncRNA作为乳腺癌早期诊断和临床治疗标志物的可能性和可靠性。
方法
收集台州市中心医院2016年9月至2017年2月期间初诊符合入选条件(2016版乳腺癌诊治标准)的女性乳腺癌患者作为研究对象。临床标本的收集经医院伦理委员会认证批准，所有的研究对象都签署知情同意书且未接受过放化疗治疗。取符合入组条件的3名乳腺癌患者的术前外周血、新鲜冷冻的乳腺癌肿瘤组织及其邻近的正常组织，取3名健康女性志愿者的外周血，志愿者均由台州市中心医院提供，排除患有相关肿瘤疾病可能。按照TRizol说明书提取每个组织和外周血标本中的总RNA。采用微阵列技术检测和筛选乳腺癌组织和外周血中miRNA和lncRNA的差异表达。分别用基因本体-GO和Pathway分析miRNA和lncRNA在乳腺癌组织和外周血中的表达谱。通过qRT-PCR进行验证后分析得到乳腺癌外周血与癌组织中表达差异的miRNA和lncRNA，并且进一步分析差异基因可能调控的相关通路，进而发现参与乳腺癌发生发展和转移过程的miRNA和lncRNA。
结果
1.通过基因芯片技术，在对3例患者乳腺癌组织和癌旁正常组织的检测中共发现了13760个上调的miRNA、2016个上调的lncRNA和6006个下调的miRNA、6875个下调的lncRNA；通过筛选发现其中有1789个具有共同差异表达趋势的miRNA,其中表达上调的miRNA有1586个，表达下调的miRNA有203个；同时也发现了437个具有共同差异表达趋势的lncRNA，其中表达上调的lncRNA有111个，表达下调的lncRNA有326个。
2.在对3例乳腺癌患者血液和3例正常对照组血液随机配对进行检测的过程中，共发现了1672个表达上调的miRNA和1440个表达下调的miRNA，但只有35个miRNA是在3组中共同表达上调和80个miRNA共同表达下调；同时也发现了1847个具有共同差异表达趋势的lncRNA，其中表达上调的lncRNA有831个，表达下调的lncRNA有1016个，但只有23个lncRNA在3组中共同表达上调和23个lncRNA在3组中共同表达下调。
3.在对筛选的差异表达的1904个miRNA进行交集分析时发现只有7个miRNA在组织和血液中同时表达下调，同时表达上调的miRNA数量为3，而两种标本中筛选的483个差异表达的lncRNA在组织和血液中表达一致的数量为0；我们还发现有28个miRNA在组织和血浆中的表达是相反的。
4.从组织中表达上调的lncRNA中筛选了差异较大且信号值较高的基因，其中5个上调的lncRNA：RP11-116A1.1、PSMD5-AS1、RP11-103J17.1、RP11-551L14.4、LINC00511和5个下调的lncRNA：RP11-660L16.2、RP11-305L7.3、AC012485.2、LINC00689、MIR181A2HG用qRT-PCR进行验证，选择GAPDH作为内参，发现有3个表达趋势不符的lncRNA(RP11-103J17.1、AC012485.2、LINC00689)，其他7个相符。
结论
1.在本次研究过程中，我们发现相对正常组织，乳腺癌肿瘤组织中表达上调的miRNA有1586个，表达下调的miRNA有203个；同时也发现了表达上调的lncRNA有111个，表达下调的lncRNA有326个。
2.在对3例乳腺癌患者血液和3例正常对照组血液随机配对进行检测的过程中，共发现了1672个表达上调的miRNA和1440个表达下调的miRNA，但只有35个miRNA是在3例乳腺癌患者血液中都表达上调和80个miRNA都表达下调的；同时在乳腺癌患者血液中还发现了831个表达上调的lncRNA和1016个表达下调的lncRNA，经过筛查发现只有23个lncRNA在3组中同时表达上调和23个lncRNA同时表达下调。
3.在对筛选的差异表达的1904个miRNA进行交集分析时发现只有7个miRNA在组织和血液中同时表达上调，同时表达下调的miRNA数量为3个，而两种标本中筛选的483个差异表达的lncRNA在组织和血液中表达一致的数量为0。说明由于个体的差异性和标本种类和状态的不同，即使是同一种疾病，其组织和血浆里的基因表达也会不同。这也为我们进一步研究带来了挑战和机会，可以针对不同的标本类型进行不同的新的肿瘤标志物的探索。
乳腺癌是严重威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤之一，随着精准医学的发展，分子靶向治疗已成为继手术、放疗、化疗后的一种极具前途的治疗方式，寻找乳腺癌有效的治疗靶点进行相应的靶向治疗已成为当前乳腺癌相关研究的热点之一。分子靶向治疗是以肿瘤细胞内特异的标志性分子为靶点,进行有效干预，从而抑制肿瘤生长和转移,并进行有效治疗。所以，寻找有效的肿瘤分子标志物是当前的主要任务。
miRNA是一类长度为18-25个核苷酸(nucleotide, nt)平均长度约为22nt左右的内源性非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、细菌等多种有机体中，并在动植物的生长发育，疾病的发生、发展及治疗预后等方面起着重要作用。研究发现，miRNA在多种肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用，它主要通过与靶mRNA3’UTR的完全或不完全配对，下调靶标基因或抑制其翻译，在转录后的水平上影响细胞的分化、繁殖、转移、凋亡等多种病理生理过程。lncRNA是一类转录本长度超过200nt且不能够翻译蛋白的功能性分子，它能够在多种层面上调控基因的表达水平，即影响基因的表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达等多个方面，广泛参与机体几乎所有生理和病理过程。越来越多的证据表明，miRNA和lncRNA的异常表达可能在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的作用，而且他们之间存在着复杂的交互作用。
本研究利用基因芯片技术筛选乳腺癌组织与正常对照组织、乳腺癌血液与正常对照血液标本差异表达的miRNA和lncRNA，筛选出具有明显表达差异的乳腺癌相关的miRNA和lncRNA基因。对筛选出的乳腺癌差异性表达的miRNA和lncRNA采用快速、敏感性高和特异性强的实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction qRT-PCR)检测，进行方法学评价及乳腺癌临床应用性能评价。筛选出的乳腺癌相关的miRNA和lncRNA，作为血液肿瘤分子标志物用于临床，对乳腺癌早期无创诊断、个体化治疗、疗效观察、预后判断等诸多方面的临床意义进行研究。探讨利用一组特征性血液miRNA和lncRNA作为乳腺癌早期诊断和临床治疗标志物的可能性和可靠性。
方法
收集台州市中心医院2016年9月至2017年2月期间初诊符合入选条件(2016版乳腺癌诊治标准)的女性乳腺癌患者作为研究对象。临床标本的收集经医院伦理委员会认证批准，所有的研究对象都签署知情同意书且未接受过放化疗治疗。取符合入组条件的3名乳腺癌患者的术前外周血、新鲜冷冻的乳腺癌肿瘤组织及其邻近的正常组织，取3名健康女性志愿者的外周血，志愿者均由台州市中心医院提供，排除患有相关肿瘤疾病可能。按照TRizol说明书提取每个组织和外周血标本中的总RNA。采用微阵列技术检测和筛选乳腺癌组织和外周血中miRNA和lncRNA的差异表达。分别用基因本体-GO和Pathway分析miRNA和lncRNA在乳腺癌组织和外周血中的表达谱。通过qRT-PCR进行验证后分析得到乳腺癌外周血与癌组织中表达差异的miRNA和lncRNA，并且进一步分析差异基因可能调控的相关通路，进而发现参与乳腺癌发生发展和转移过程的miRNA和lncRNA。
结果
1.通过基因芯片技术，在对3例患者乳腺癌组织和癌旁正常组织的检测中共发现了13760个上调的miRNA、2016个上调的lncRNA和6006个下调的miRNA、6875个下调的lncRNA；通过筛选发现其中有1789个具有共同差异表达趋势的miRNA,其中表达上调的miRNA有1586个，表达下调的miRNA有203个；同时也发现了437个具有共同差异表达趋势的lncRNA，其中表达上调的lncRNA有111个，表达下调的lncRNA有326个。
2.在对3例乳腺癌患者血液和3例正常对照组血液随机配对进行检测的过程中，共发现了1672个表达上调的miRNA和1440个表达下调的miRNA，但只有35个miRNA是在3组中共同表达上调和80个miRNA共同表达下调；同时也发现了1847个具有共同差异表达趋势的lncRNA，其中表达上调的lncRNA有831个，表达下调的lncRNA有1016个，但只有23个lncRNA在3组中共同表达上调和23个lncRNA在3组中共同表达下调。
3.在对筛选的差异表达的1904个miRNA进行交集分析时发现只有7个miRNA在组织和血液中同时表达下调，同时表达上调的miRNA数量为3，而两种标本中筛选的483个差异表达的lncRNA在组织和血液中表达一致的数量为0；我们还发现有28个miRNA在组织和血浆中的表达是相反的。
4.从组织中表达上调的lncRNA中筛选了差异较大且信号值较高的基因，其中5个上调的lncRNA：RP11-116A1.1、PSMD5-AS1、RP11-103J17.1、RP11-551L14.4、LINC00511和5个下调的lncRNA：RP11-660L16.2、RP11-305L7.3、AC012485.2、LINC00689、MIR181A2HG用qRT-PCR进行验证，选择GAPDH作为内参，发现有3个表达趋势不符的lncRNA(RP11-103J17.1、AC012485.2、LINC00689)，其他7个相符。
结论
1.在本次研究过程中，我们发现相对正常组织，乳腺癌肿瘤组织中表达上调的miRNA有1586个，表达下调的miRNA有203个；同时也发现了表达上调的lncRNA有111个，表达下调的lncRNA有326个。
2.在对3例乳腺癌患者血液和3例正常对照组血液随机配对进行检测的过程中，共发现了1672个表达上调的miRNA和1440个表达下调的miRNA，但只有35个miRNA是在3例乳腺癌患者血液中都表达上调和80个miRNA都表达下调的；同时在乳腺癌患者血液中还发现了831个表达上调的lncRNA和1016个表达下调的lncRNA，经过筛查发现只有23个lncRNA在3组中同时表达上调和23个lncRNA同时表达下调。
3.在对筛选的差异表达的1904个miRNA进行交集分析时发现只有7个miRNA在组织和血液中同时表达上调，同时表达下调的miRNA数量为3个，而两种标本中筛选的483个差异表达的lncRNA在组织和血液中表达一致的数量为0。说明由于个体的差异性和标本种类和状态的不同，即使是同一种疾病，其组织和血浆里的基因表达也会不同。这也为我们进一步研究带来了挑战和机会，可以针对不同的标本类型进行不同的新的肿瘤标志物的探索。