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第一部分IL-34调节慢性阻塞性肺疾病中CD4+Treg分化的研究目的:课题组前期研究报道CD4+CD25+Foxp3+T细胞（CD4+Treg）亚群表达和功能不足与慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的异常免疫相关。但是Treg在COPD患者中低表达的原因及调控机制并没有被充分阐明。本研究旨在探究interleukin-34（IL-34）在慢性阻塞性肺疾病中对CD4+Treg细胞的分化影响及其机制。方法:1.首先,分析健康不吸烟组（HC组）、肺功能正常吸烟组（HS组）和COPD组的临床特征,接着通过流式细胞术（简称流式）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-34在三组人群外周血单个核细胞和血清中的表达情况。2.应用流式检测外源性的IL-34对CD4+T细胞各亚群表达变化。3.向na（?）ve CD4+T细胞加入IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α,TGF-β1,IFN-γ、CSE（cigarette smoke extract,香烟提取物）等刺激因子,再用流式检测IL-34在CD4+T细胞中的表达变化。4.应用ELISA检测IL-34处理后的CD4+na（?）ve T细胞中细胞因子（IL-4,IL-6,IL-10,IL-12,TNF-α,TGF-β1,IFN-γ）的表达变化。5.最后通过Western Blot实验来研究IL-34调控Treg分化的分子机制。结果:1.HS组和COPD组血清和PBMC中IL-34的表达较HC组显著增加,且IL-34的水平和吸烟指数呈正相关。重度和极重度COPD患者血清中IL-34的表达显著高于轻度至中度COPD患者,提示COPD患者血清中IL-34的表达水平可以反映疾病的严重程度。2.外源性的IL-34能够降低CD4+Treg中Foxp3和CD25的表达,加入IL-34的中和性抗体后则可以抑制此效应,而IL-34不影响其他的Th细胞亚群Th1、Th2、Th9、Th17和Th22)的表达。另外,我们没有观察到IL-34能显著改变CD4+Treg对na（?）ve CD4+T细胞的抑制作用。3.炎性因子IL-17、TNF-α、IFN-γ和CSE能够显著诱导na（?）ve CD4+T细胞中IL-34的表达增加。4.IL-34处理后的na（?）ve CD4+T细胞分泌高水平的IL-6和IL-12和低水平的IL-10。5.外源性的IL-34能够显著促进na（?）ve CD4+T细胞中p-PI3K,p-Akt,p-m TOR的表达;而加入LY294002（PI3K抑制剂）后,p-PI3K,p-Akt,p-m TOR的表达下降。结论:COPD患者PBMC和血清中IL-34的表达增加,且与慢阻肺的严重程度呈正相关。IL-34通过PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制CD4+Treg的表达。第二部分:miR-31通过IL-34调控慢性阻塞性肺疾病中CD4+Treg的分化目的:本研究拟筛选出调控IL-34的micro RNA,并研究其作用方式。进一步探究miR-31是否调节IL-34的表达与功能（抑制Treg分化）。方法:1.应用生物信息学分析筛选出能够靶向调控IL-34表达的micro RNAs。应用双荧光素酶报告试验（Double luciferase report assay）来验证miR-31能否直接与IL-34的3’UTR区结合。2.检测HC、HS和COPD三组人群PBMC中miR-31的表达。通过向na（?）ve CD4+T细胞中加入CSE,观察其对miR-31的表达影响。3.在na（?）ve CD4+T细胞加入miR-31 inhibitors或者mimics,流式检测IL-34+细胞所占比例变化。4.向na（?）ve CD4+T细胞中转染miR-31 inhibitors或者mimics,流式检测CD4+Treg的比例;在此基础上加入IL-34的中和抗体或外源性IL-34细胞因子,再检测CD4+Treg的表达变化。结果:1.通过生信分析,我们筛选出IL-34的上游miR-31,双荧光素酶报告实验进一步证明miR-31能够直接与IL-34的3’UTR区结合。2.与HC组相比,miR-31的表达在COPD患者的PBMC降低;在na（?）ve CD4+T细胞中加入CSE后,miR-31的表达下降。3.在na（?）ve CD4+T细胞中转染miR-31 inhibitors后,细胞中IL-34+T细胞比例增加;而转染miR-31 mimics后,IL-34+T细胞比例下降。4.在na（?）ve CD4+T细胞中转染miR-31 inhibitors后,Foxp3和CD25的表达下降,在此基础上加入IL-34中和抗体后,Foxp3和CD25的比例增加。miR-31 mimics转染na（?）ve CD4+T细胞后,细胞中Foxp3和CD25的表达增加;在此基础上再加入外源性IL-34,Foxp3和CD25的表达水平下降。结论:miR-31能够直接与IL-34的3’UTR区结合并抑制其翻译,进而影响Treg的分化和功能。在na（?）ve CD4+T细胞中加入CSE刺激会导致miR-31的表达下降。