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背景和目的：肝肺综合征（(hepatopulmonary syndrome，HPS）是慢性肝病的一种严重并发症，在肝硬化中发病率高达15%，也是引起肝移植围手术期移植肝无功能及肺部感染的主要原因，已经成为国内外研究热点。目前对于HPS的发病机制仍不明确，多数学者认为肺内微血管扩张和分流的形成，加之缺氧性肺血管收缩（hypoxic pulmonaryvaso constriction，HPV）受损和高动力循环的存在，导致HPS的发生发展。HPS主要表现为肺内微血管异常扩张、气体交换障碍、动脉血氧合作用异常，其中以肺微血管扩张为主要病理改变，扩张的微血管导致血红蛋白氧合困难产生难治性低氧血症和低氧肺血管重建（肺平滑肌细胞的异常增殖导致肺动脉壁增厚）而进一步加重低氧血症。肺微血管主要构成细胞为肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascularendothelial cells，PMVECs），目前的研究认为肺微血管的扩张主要是由于PMVECs的异常增殖引起，该病理改变不具有可复性，而在对HPS病人行肝移植术后发现，肺微血管存在一定的收缩，该现象无法单纯用PMVECs增殖解释；同时在我们的前期实验中发现在HPS大鼠血清诱导的部分PMVECs内检测出肌性蛋白MPH、SM-α-actin、 calponin的表达，提示PMVECs发生肌样化改变。转化生子因子(transforming growth factor beta-1，TGF-β1)及Smad蛋白在细胞的增殖、分化及迁移中起重要调节作用。研究发现，Smad7在促进肌性分化中起着重要并且必要的作用，另外TGF-β1/Smad中上调Smad7和下调Smad3表达均对成纤维细胞样分化起一定的抑制作用，基于以上理由，我们推测：慢性肝病导致多种细胞因子释放，通过血液循环达到肺脏，作用于肺微血管内皮细胞，通过TGF-β1/Smad信号通路引起PMVECs发生肌样分化，进一步加重肺内微血管扩张，导致HPS的发生发展，这就是本研究立题的目的。本研究采用构建HPS大鼠模型，制备HPS血清，培养原代PMVECs，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）、蛋白印迹（Western Blot）、免疫荧光（immunofluorescence）等实验方法检测HPS大鼠血清培养的PMVECs内细胞分化情况及信号通路中蛋白表达变化，探讨HPS发生发展的机制。方法：实验分三部分1.构建HPS大鼠模型，制备血清采用慢性胆总管结扎（CBDL）构建HPS大鼠模型，2周后行病理切片及血气分析，成功后制备血清。2. PMVECs的原代培养及其肌样分化的检测正常大鼠（2月龄），取肺边缘组织行原代培养、纯化及鉴定PMVECs。PMVECs随机分为2组：对照组（C组）和HPS干预组（HPS组），37%二氧化碳孵育箱中培养24、48和72h（T1、T2、T3）后，采用显微镜下观察细胞形态变化及western blot检测肌性蛋白表达探索PMVECs肌样分化。3. TGF-β1/Smad信号通路中关键蛋白以及mRNA表达的检测C组和HPS组PMVECs在3个时相点采用RT-PCR和western blot法分别检测TGF-β1mRNA、Smad3mRNA及其蛋白表达，及采用免疫荧光对Smad3蛋白细胞内定位。结果：1. HPS大鼠血清对PMVECs肌样分化的影响1)在倒置显微镜下观察：C组培养细胞状如梭形或多角形，呈“铺路石样”排列，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形，胞浆丰富。HPS组培养细胞呈长梭形排列，核呈杆状或椭圆状。2) C组PMVECs内未见平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle-Cardiac myosinheavy chain，SM-MHC）、平滑肌肌动蛋白α(smooth muscle-α-actin，SM-α-actin)、肌钙蛋白(calponin)蛋白表达；HPS组PMVECs内SM-MHC SM-α-actin、calponin蛋白表达阳性；与Tl时比较，T2、T3时HPS组PMVECs内SM-MHC、SM-α-actin、calponin蛋白表达增加(P<0.05)；与T2时比较，T3时HPS组PMVECs内SM-MHC、SM-α-actin、calponin蛋白表达增加(P<0.05)。2. TGF-β1/Smad信号通路中关键蛋白以及mRNA表达的检测1)与C组比较，HPS组PMVECs内TGF-β1mRNA及其蛋白表达增加(P<0.05)；与Tl时比较，T2、T3时HPS组PMVECs内TGF-β1mRNA及其蛋白表达增加(P<0.05)；与T2时比较，T3时HPS组PMVECs内TGF-β1mRNA及其蛋白表达增加(P<0.05)。2) C组与HPS组PMVECs内Smad3mRNA及其蛋白表达大致相同。3) C组PMVECs内见绿色荧光主要表达在细胞质中；而HPS组PMVECs内绿色荧光则主要定位在细胞核中。结论：1.在HPS大鼠血清的刺激下，PMVECs细胞形态发生改变，以及细胞内肌性蛋白表达上调，提示HPS大鼠血清可通过相关途径导致PMVECs发生肌样分化。2. HPS大鼠血清诱导的PMVECs内TGF-β1蛋白及其mRNA表达增强，而Smad蛋白及其mRNA表达无明显变化，免疫荧光定位出现核转移，提示TGF-β1/Smad信号途径参与PMVECs肌样分化的调节，在HPS的发生发展过程起着重要作用。