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基因工程抗体由于其特异性强、副作用低等特点在临床上将发挥越来越重要的作用,如应用于抗癌、免疫相关疾病等治疗。据统计在2010年前将有超过100种抗体应用于临床。抗体工程研究中有两个难点:一是抗体的人源化,以解决影响抗体的HAMA问题;二是抗体的大规模表达,即生产足够量的抗体以供临床应用。随着抗体工程研究的深入,前者已经不成问题,如利用Xenogene小鼠可以产生高度特异的完全人源性单克隆抗体;而后者却因为对真核细胞复杂的表达调控机制认识不充分而存在困难,目前由细胞工程生产的抗体价格昂贵(平均US$200/100mg),影响其应用,所以如何提高抗体的表达量,降低成本,是当前迫切的要求。 影响抗体表达量的因素从总体上来看主要有三个方面,即抗体表达载体构建、宿主细胞选择和改造、细胞规模培养和生产工艺。其中表达载体构建是核心技术,包括通用载体的构建和对抗体基因本身的优化。本室以往的研究已经对基于CHO/dhfr~-的表达系统进行了比较深入的研究,例如构建了一系列行之有效的蛋白质表达载体。本研究利用本室现有的抗HBsAg抗体作为模型蛋白,对影响抗体表达量的抗体基因自身因素进行分析,以供抗体表达系统构建时抗体基因设计提供参考。 首先采用仓鼠的密码子偏性对轻链基因进行改造,目的是解决在翻译过程中因CHO细胞中稀有密码子产生的蛋白质合成速度瓶颈。在设计了去除稀有密码子的轻链基因序列后,用合成寡核苷酸序列的方法,PCR拼接合成了优化的轻链序列,并且构建了其真核表达载体,采用和克隆于高效表达载体的重链基因共转染的方法,在CHO细胞中表达。结果表明,瞬时表达和克隆化细胞表达时优化后序列和原序列差异不显著,说明抗体在较低水平(表达蛋白量占细胞总蛋白质量的0.1-0.5%)表达时,稀有密码子的利用度还不构成蛋白质合成的瓶颈。由于异源蛋白在大肠杆菌和酵母细胞中表达时,稀有密码子的改造能大幅度提升表达量,以及有CHO细胞表达EPO(促红细胞生产素)人源性优化密码子后表达量提高的先例,所以我们估计,在抗体表达量达到一定比例后,密码子优化的抗体序列才能有效地发挥作用。 其次,根据资料选择和克隆了3种高效的信号肽序列,包括仓鼠β-酪蛋白信号肽序列(+接头序列)、杆状病毒p67蛋白信号肽序列、并对原有轻链信号肽序列进行了优化。把各种信号肽序列替换了原信号肽序列后,转染CHO细胞进行表达,结果其中原有轻链信号肽优化的抗体表达量最高,比原轻链表达载体提高4倍以上,含仓鼠β-酪蛋白信号肽序列的轻链表达载体提高约2倍,p67蛋白信号肽在稳定表达的细胞克隆上也有显著提高。这些结果说明,其它类型的蛋白质信号肽序列可以用于抗体表达,并且无须接头序列,我们的实验表明接头序列