人体内的黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XO)主要分布在肝脏与肾脏中,负责调节嘌呤分解代谢,促进次黄嘌呤和黄嘌呤向尿酸转化,同时伴随着超氧阴离子(O2-)的生成。当体内XO活性异常升高,一方面代谢紊乱导致尿酸分泌过多,另一方面人体缺乏尿酸氧化酶,尿酸不能进一步分解成可溶性尿囊素,引发高尿酸血症,而过量的尿酸盐结晶机体组织中沉积下来造成损害进一步发展为痛风。此外,过量的O2-自由基会导致包括细胞损伤、中风、糖尿病、动脉粥样硬化和肝障碍等多种疾病。如今痛风已逐渐上升为我国代谢类疾病的第二位,严重危害我国人民身体健康。鉴于XO在尿酸生成中的关键作用,抑制XO活性成为了治疗高尿酸血症和痛风的主要手段之一。研究表明,目前临床上常用的高尿酸血症和痛风治疗药物如别嘌呤醇和非布索坦等会对人体造成一定的毒副作用。因此,找寻并筛选出低毒高效的新型XO抑制剂具有重要的意义。黄酮类化合物是一种多酚类次生代谢产物,广泛分布于许多可食性植物中,具有抗炎、心脏保护、抗糖尿病、抗癌等多种生物活性且可以有效抑制XO活性,引起了人们极大的关注。本论文选取黄芩素、黄芩苷、漆黄素和橙皮素为研究对象,测定了上述四种黄酮类物质对XO的体外抑制作用、抑制动力学、结合性质及对酶结构的影响,研究了黄芩素(黄芩苷、漆黄素或橙皮素)与别嘌呤醇联合使用对XO活性的抑制效应;探讨了几种可溶性糖类(果糖、蔗糖或水苏糖)存在时对漆黄素抑制XO活性能力的影响及机制。此外,以橙皮素为原料,合成了橙皮素-铜配合物并将其与橙皮素抑制XO活性的能力及机制进行比较分析。主要结果如下:1、在体外正常人体生理酸度条件(pH7.4,37℃)下,运用酶促动力学分析方法,研究黄芩素、黄芩苷、漆黄素和橙皮素对XO的抑制作用。结果表明,四种黄酮类化合物均具备较好的XO活性抑制能力,黄芩素、黄芩苷、漆黄素和橙皮素抑制尿酸生成的半数抑制浓度ICs0值分别为(7.54±0.06)×10-6、(1.23±0.03)××10-4、(3.93±0.12)×10-6和(1.17±0.12)×10-5mol L-1,抑制能力由强到弱为:漆黄素>黄芩素>橙皮素>黄芩苷。黄芩素、黄芩苷和漆黄素对XO显示出混合型抑制类型,而橙皮素为竞争型XO抑制剂。此外,利用等效图谱法发现,黄芩素、漆黄素和橙皮素与别嘌呤醇联合抑制XO活性时均表现出一定的协同作用,其中橙皮素与别嘌呤醇协同作用最强;而黄芩苷与别嘌呤醇联用时除了在抑制50%XO活性时两者显示出协同效应,其余均表现为拮抗作用。2、黄芩素等四种黄酮类化合物均能明显抑制XO反应体系O2-自由基生成,其 ICs0值分别为 6.97×10-6、10.21×10-6、2.96×10-6和2.66×10-6 mol L-1,抑制能力由强到弱为:橙皮素>漆黄素>黄芩素>黄岑苷。通过比较分析抑制剂清除DPPH自由基和非酶体系中O2-自由基的能力发现,黄芩素与漆黄素都是同时通过促进XO分子还原和抑制尿酸生成达到抑制XO催化体系中O2-自由基产生的目的,而黄芩苷和橙皮素主要通过还原XO分子,使得FADH·/FADH2电子对具有更高的还原电位,进而促进还原铁中心和钼的分子内电子再生,另一个电子被提供给O2-自由基以形成H2O2,最终导致O2-生成减少。3、采用荧光滴定实验结合分子对接技术深入研究黄芩素等4种黄酮类物质与XO的结合作用。黄芩素、漆黄素和橙皮素均可静态猝灭XO的内源性荧光,而黄芩苷与XO的相互作用中则同时存在静态和动态猝灭。受到氢键和疏水作用力的共同驱动,黄芩素等四种黄酮类化合物都能与XO自发地进行结合,且均在XO上存在一个结合位点。在298 K下,四种黄酮类化合物与XO形成复合物的结合常数Ka由大到小为:黄芩素[(9.10±0.03)×104L mol-1]>黄芩苷[(8.93±0.02)×104 L mol-1]>橙皮素[(8.27±0.03)×104 L mol-1]>漆黄素[(5.97±0.02)×104 L mol-1]。同步荧光实验显示黄芩素或漆黄素对XO分子内两种发光氨基酸(色氨酸和酪氨酸)残基周围的极性和疏水性几乎无影响;而黄芩苷或橙皮素的结合能够增加XO分子中的色氨酸残基周围的极性,并降低疏水性。黄芩素(黄芩苷、漆黄素或橙皮素)结合XO的位点更靠近色氨酸残基,从而对XO的内源荧光猝灭的贡献更大。分子模拟表明,黄芩素、黄芩苷或漆黄素能顺利进入XO的疏水性空腔,橙皮素则直接插入XO催化底物转化的活性中心。4种黄酮类物质均能与XO结合并诱导其构象改变,黄芩素、黄岑苷或橙皮素使得XO中α-螺旋含量和无规则卷曲含量上升,并降低了β-转角和β-折叠的含量,而漆黄素则使XO的α-螺旋含量和β-折叠含量上升,减少β-转角和无规则卷曲的含量。4、根据上述实验结果推测所选取的四种黄酮类化合物抑制XO活性的机理为:黄芩素、黄芩苷或漆黄素通过进入XO的FAD活性中心,并与异咯嗪环周围的氨基酸残基结合,抑制了 FAD位点对O2-自由基的释放,导致另一个电子从FADH2转移到O2-自由基形成H2O2,阻断了酶催化反应的进行从而达到抑制XO催化活性的目的。而橙皮素则通过竞争型方式进入到XO的Mo-Pt活性中心,阻碍底物进入酶催化反应的活性中心,并影响电子传递链的正常运行,降低XO催化黄嘌呤的速率。同时,黄芩素等黄酮与XO的结合诱导其的构象发生变化,使得XO的二级结构趋向紧密,不利于暴露其活性空腔,降低酶与黄嘌呤的结合机率,从而削弱酶的催化能力。5、果糖、蔗糖或水苏糖既不与XO发生相互作用也不具备抑制XO活性能力,但均可降低漆黄素对XO的抑制作用,其影响漆黄素ICs0值的能力大小排序为果糖>蔗糖>水苏糖。同时,果糖等不改变漆黄素对XO的抑制类型和猝灭类型,但可显著降低漆黄素与XO的结合常数与猝灭常数,且降低趋势与影响漆黄素抑制酶活能力呈正相关。此外,在疏水作用力和氢键共同驱动下,果糖/蔗糖/水苏糖-漆黄素能与XO的进行自发结合,推测果糖等可溶性糖类能够与漆黄素结合进而削弱其对XO活性的抑制能力,且随着单个糖分子中的单糖结构的增多,这种结合作用的降低使得可溶性糖类保护酶活能力的下降。6、合成并测定了橙皮素-铜配合物对XO活性的抑制作用,结果表明配合物对XO的抑制能力显著增强,其IC50值[(1.07±0.08)×10-6 mol L-1]明显小于配体橙皮素[(1.17±0.12)×10-5mol L-1]和铜离子[(4.93±0.21)×10-6mol L-1],抑制常数Ki值为1.18×10-6mol L-1,表观系数α为3.63。相比于只能与XO络合的橙皮素,配合物不仅能与黄嘌呤竞争结合位点,还可与黄嘌呤-XO复合物结合,说明螯合铜离子使得橙皮素-铜配合物具有更多抑制XO活性的途径。虽然配合物的抗氧化性低于橙皮素,但仍然可以通过抑制尿酸的形成进而抑制酶促反应中O2-自由基生成。橙皮素-铜配合物可显著静态猝灭XO的内源荧光,且相同温度下,其Ksv值与Ka值均高于橙皮素,说明配合物与XO之间存在良好稳定的亲和力,且主要受疏水作用力和氢键驱动。相同浓度的铜配合物使得色氨酸残基的荧光强度下降更多,表明其更靠近配合物与XO的结合位点,但几乎不对XO分子中的酪氨酸和色氨酸的极性和疏水性产生影响。此外,配合物诱导XO中β-折叠和β-转角含量上升,而α-螺旋及无规则卷曲含量下降,说明此时XO的结构变得松散,不利于黄嘌呤进入反应活性中心,从而使XO失去催化活性。