一、背景和目的梗阻性黄疸是外科的急重症,造成肝脏严重损害。即使有效解除梗阻,肝功能恢复正常仍需较长时间,严重者可导致不可逆性肝损害。目前尚无系统地基础研究观察梗阻性黄疸对肝细胞损害以及梗阻解除后肝脏恢复的动态过程。缺乏以此为依据的客观临床治疗方案。炎症是梗阻性黄疸的特征性病变,包括门脉水肿、中性粒细胞浸润、胆道上皮细胞增殖,最终导致门脉纤维化等形态学改变。随着黄疸导致的炎症进一步进展,肝细胞损害逐渐加重,成熟的和新生的胆管上皮细胞和肝脏干细胞开始增殖和修复过程。最新研究证实,胆管上皮实质细胞转化在组织的重建过程中起关键作用。当然,过度增殖导致肝脏的结构的紊乱、影响肝脏功能,有恶变的可能。Hedgehog信号传导通路对细胞分化、生长,以及肿瘤的发生有重要意义。有研究表明,它还有可能在某些肝脏病变中起调控肝脏干细胞增殖和上皮实质细胞转化修复过程的关键作用。因此,本研究通过结扎Wistar大鼠胆总管,造成胆管梗阻,并通过置入硅胶管造成体外引流以解除梗阻,模拟胆管梗阻再通的病理状态,通过免疫组化、PCR技术,探讨Hedgehog信号传导通路在调控肝脏损伤修复过程中的表达、作用及调控机制,为进一步从治疗上干预肝脏修复的过程提供科学依据。二、材料与方法雄性Wister大鼠150只,体重250-300克,随机分为3组。探查组(对照组)：行对照手术,分离、探查胆管但不结扎；梗阻组：行肝门部胆道结扎术；梗阻再通组(梗通组)：胆道结扎后7天行再通术。分别以大鼠初次术后1、3、7、8、10、14天处死,取血及肝脏标本,每组每个时间点造成功6只。血标本取自处死时腹主动脉血,肝脏标本：处死时取肝右叶应用4%福尔马林固定,留作组织学分析,取肝左叶-70℃冻存,留作PCR监测。1、通过肝功能(TBIL、DBIL、ALT、AST)观察不同时间点肝脏的炎症反应。2、通过肉眼及HE染色观察胆管梗阻再通不同时间点时肝脏形态改变。3、免疫组化(Ptchl)评价蛋白水平Hedgehog信号传导通路的表达。4、PCR检测各目的基因：Hedgehog信号传导通路(Ptchl, Gli2)及肝脏修复、纤维化进程的相关基因(TGF-β1),观察其在不同时间点的表达。三、结果1、肝功能结果对照组各个时间点间无明显差异。TBIL及DBIL在梗阻1-3天内呈上升趋势,3-7天呈缓慢增长甚至呈下降趋势；再通后0-1天内呈上升趋势,之后呈逐步下降趋势。两实验组中ALT及AST在1-8天呈下降趋势,梗通组8-10天逐渐上升,之后逐步下降,梗阻组手术8天后呈下降、趋缓态势。2、大体结果对照组肝脏标本各肝叶色泽红润、表面光滑。梗阻组可见肝脏黄染、肿胀、淤血、水肿；福尔马林固定后可见表面粗糙、颜色灰白等肝组织早期肝纤维化的表现。胆管再通后肝脏肿胀、淤血、水肿及早期肝纤维化均较前减轻。3、HE染色结果对照组术后随时间进展肝脏损伤、纤维化程度变化不明显。梗阻组术后随时间的延长,肝细胞发生变性坏死程度加重,伴有大量中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,部位从从胆管梗阻处逐渐转向肝门,从汇管区扩展至肝小叶甚至整个肝叶结构破坏；此过程也伴随了新的胆管增生。梗通组1-7天及7-8天与梗阻组变化一致,随时间进展肝损伤及纤维化程度逐渐加重。再通3天以后,肝细胞变性坏死较前减轻,肝小叶坏死范围变小,肝门区胆管增生放缓,纤维细胞减少。4、免疫组化结果对照组分别与其它两实验组有明显差异。两实验组在梗阻手术7天后有统计学差异。Ptchl免疫组化阳性染色的细胞数目及分布范围随着梗阻时间的延长而增加,在3-7天增长最快。Ptchl阳性细胞表达部位主要位于新汇管区胆管及肝间质新增生胆管及无管腔的小胆管细胞胞浆中。5、PCR结果对照组目的基因表达较弱,梗阻组和梗通组表达较强。对照组变化不明显。对不同组相同时间点的研究发现：两实验组中Ptch1、Gli2在8-14天,TGF-β1指标在10-14天的差异有统计学意义；除了Gli2组的1-3天外,两实验组与对照组之间在各个时间点都有统计学意义。对相同组不同时间点的表达统计显示：两实验组中TGF-β1在1-3天、Ptchl及Gli2在3-7天的增长有显著统计学差异。四、结论1、研究发现大鼠梗阻性黄疸模型出现肝脏损伤、炎症反应、胆管上皮细胞实质化、纤维化等过程。Hh信号通路参与胆管梗阻后损伤的修复过程,其时序性变化趋势与肝脏损伤修复的肝功能及病理变化、免疫组化变化相一致,与之具有相关性。2、研究发现两处理组目的基因比探查组表达较强。在两处理组中,1-7天时,随着结扎天数的增加表达量逐渐增强,探查组无明显变化。其中Ptch1、Gli2与损伤修复的病理变化、炎症反应及纤维化的进程相一致,TGF-β1与促进肝脏纤维化过程有关。3、研究发现在损伤修复过程中的3-7天是纤维化过程的特殊时期,第3天之前以肝损害加重、促纤维化过程为主,第3-7天恰好相反,第7天之后为持续缓慢的损伤及肝脏纤维化进程。对于梗通组来说,从梗阻7天到再通1天肝脏的损伤继续加重,再通1天时损伤达到一个小高峰,之后损伤修复占主导地位,出现抗纤维化、上皮细胞实质化。