磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一。它既是核酸、磷脂、ATP和蛋白质的重要组成成分,又直接参与植物体内的光合作用、能量转移、信号转导、等各种生化过程。由于土壤中的磷容易被钙、铁、铝等金属离子固定,植物根系可以吸收利用的磷非常有限。因此,土壤中磷的有效性是水稻等作物产量的重要限制因子。为了更好的适应环境中的供磷胁迫,植物进化出了一系列复杂而精确的调控机制,其中包括了对环境中磷信号的识别和传递。对于植物来说磷信号又可分为局部磷信号和系统性磷信号。已有的研究表明,植物改变根系形态是对局部磷胁迫信号的响应,包括主根变短、侧根、根毛发育的增强等,这些变化旨在扩大根系与土壤的接触面积,从而提高植物对磷的吸收效率。铁氧化酶 LPR1（Low Phosphate Root）和 P₅ 型 ATPase PDR2（Phosphate Deficiency Response 2）是参与拟南芥主根根尖响应局部磷信号的关键酶。二者缺磷条件下,通过调节缺磷胁迫下水稻根尖细胞中铁离子的活性,调控根尖静止中心附近胼胝质的积累,实现对根尖细胞正常分化发育的抑制。除了对缺磷胁迫下主根发育的调控,还有研究发现,PDR2可能在细胞内膜系统向细胞膜囊泡运输过程中发挥重要功能,并参与了花药发育和拟南芥体内养分利用过程。本文通过与拟南芥中AtLPR1、AtPDR2序列比对,在水稻基因组数据库中找到五个LPR同源基因,命名为OsLPRl-OsLPR5;一个PDR2同源基因OsPDR2。利用组织定位、定量PCR等技术研究了 OsLPR1-OsLPR5和OsPDR2基因的生物信息学特征和表达模式。利用过量表达材料和RNAi沉默转基因材料研究了OsLPR5和OsPDR2在水稻生长发育及磷素的吸收、转运及分配中的功能。主要研究结果如下:1.根据拟南芥中AtLPR1氨基酸序列,在水稻中找到五个LPR的同源基因,根据他们与AtLPR1序列一致性的高低,命名为OsLPR1-OsLPR5。通过Blastp比对分析,获得29种植物中共53个LPR同源基因。对其多序列比对和进化树分析发现,LPR同源基因在单子叶作物和双子叶作物中具有明显的分离。单子叶植物中的LPR同源基因又可分为三个分支。OsLPR2位于分支一,OsLPR1、OsLPR3-OsLPR5位于分支二,OsLPR3与OsLPR5在进化关系上非常接近。OsLPR1、OsLPR3-OsLPR5都具有三个典型的铁氧化酶结构域:Cu-oxidase Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。OsLPR2具有Cu-oxidase Ⅰ,Ⅲ缺少典型的Cu-oxidaseⅡ结构域。对铁氧化酶氨基酸特征序列分析发现,OsLPR3和OsLPR5与植物代表性铁氧化酶AtLPR1关键位点一致,蛋白三级预测结构也与AtLPRl和Fetp相似。另外,亚细胞定位分析发现,OsLPR5可能定位于内质网和细胞核中。2.根据拟南芥中AtPDR2氨基酸序列,在水稻中找到PDR2的同源基因,并通过RACE方法,克隆获得水稻中OsPDR2基因的全长序列。该基因共含有21个外显子,20个内含子。亚细胞定位分析发现,OsPDR2可能定位于内质网中。3.通过定量PCR检测,发现OsLPR1在水稻不同发育时期和不同组织器官中均有表达。OsLPR2在叶片中表达强烈,地下部表达相对较弱。OsLPR3和OsLPR5表达模式相近,苗期主要在根中表达,其他组织表达较弱。OsLPR4在叶鞘和根中表达较强。组织定位材料分析发现OsLPR5在水稻生殖生长阶段,茎节和叶节中具有较强的表达。通过不同缺素处理发现,OsLPR1、OsLPR2在缺钾处理的根中表达上调明显,对其它缺素处理响应不明显;OsLPR3在缺磷、缺钾处理的根中表达量上调,缺氮处理的根中表达量明显下调;OsLPRP在缺磷、缺钾处理的根中表达量上调;OsLPR5在缺磷处理的根中表达量上调明显,缺铁处理的根中有小幅上调,缺氮处理的根中表达量显著下调。通过不同缺磷时间点表达分析发现,缺磷7天时,OsLPR4在根系中表达量上升显著。而OsLPR3和OsLPR5的表达量在缺磷24小时即显著上升,因此,两者作为我们深入研究的基因。4.通过定量PCR检测发现,OsPDR2在水稻不同发育时期和不同组织器官中均有表达。在营养生长阶段,叶片和叶鞘中的表达较其他器官表达更强。水稻地上部和根系细胞中OsPDR2对长期缺磷响应显著。在短期缺磷7天情况下OsPDR2的表达没有显著变化;缺磷21天时,水稻地上部OsPDR2表达量显著上升,地下部OsPDR2表达量则显著下降;缺磷21天后回补磷1天时,OsPDR2的表达量较长期缺磷的处理也没有显著变化。说明OsPDR2表达水平响应长期磷饥饿信号,短期缺磷其表达水平没有显著变化。5.酵母和本氏烟草异源系统中表达OsLPR5实验表明,与空载体相比,表达OsLPR5材料中铁氧化酶活性均显著提高。同时,我们检测了OsLPR 过量表达水稻材料地上部、根系中铁氧化酶活性。结果发现,与野生型相比,其铁氧化酶活性均显著上升,木质部伤流液中三价铁的比例也大幅提高。经过酵母和本氏烟草的异源系统和OsLPR5过量表达材料的同源系统中的验证,OsLPR5基因编码一个编码铁氧化酶基因。6.通过对OsLPR5基因过量表达材料及野生型的表型分析,发现OsLPR5的过量表达影响了水稻的生长和发育。在植株铁营养充足的条件下,正常供磷处理的OsLPR5的过量表达材料生物量显著低于野生型;OsLPR5的过量表达材料主根根长、不定根根长和侧根根长均低于野生型;OsLPR5的过量表达导致侧根根尖细胞正常发育受到一定程度的抑制。盆栽实验结果表明,OsLPR5的过量表达影响了水稻株高、有效分蘖数、穗分支数、结实率等农艺形状,并导致水稻单株产量下降。说明OsLPR5在水稻的生长发育过程中有重要作用。7.不同供磷水平水培实验结果表明,OsLPR5的过量表达影响了水稻对磷的吸收、转运和生长后期体内磷的转运与再分配。在植株铁营养充足的条件下,OsLPR5过量表达导致水稻地上部磷水平的提高。同位素32P吸收实验结果表明,正常供磷条件下,OsLPR5过量表达显著提高了水稻对磷的吸收和向地上部的转运。OsLPR5过量表达材料木质部伤流液中可提取磷含量也显著提高。营养生长后期,OsLPR5过量表达改变了水稻体内磷的分配,收获后茎杆和叶鞘中磷浓度显著上升,而在叶片、籽粒中的磷浓度均没有变化。8.通过对OsPDR2-RNAi沉默材料及野生型的表型分析,发现OsPDR2-RNAi沉默材料中OsPDR2的部分沉默影响了水稻的生长和发育。在苗期不同供磷处理中,OsPDR2-RNAi沉默材料叶片、叶鞘、根系生物量较野生型均显著下降。盆栽实验中,与野生型相比,OsPDR2-RNAi沉默材料在各生育期株高均显著降低、分蘖总数减少,二级、三级分蘖的比例上升;对繁育器官的分析发现,OsPDR2-RNAi沉默材料在扬花期正常开裂的花药比例较野生型显著下降,且花粉育性较野生型有所降低;收获后对农艺形状的分析发现,OsPDR2-RNAi沉默材料有效分蘖数、穗分支数、穗长、结实率较野生型显著下降,并导致水稻单株产量下降,而且籽粒的长度和宽度也有所下降。说明OsPDR2对在水稻的各个生长发育阶段和多个器官的生长发育过程中有重要作用。不同供磷处理条件下,OsPDR2-RNAi沉默材料种子根长度和不定根长度较野生型均显著变短,在正常供磷条件下变短的程度较缺磷处理更加显著。对根系细胞结构分析发现,OsPDR2-RNAi沉默材料种子根成熟区细胞长度较野生型均有所下降,种子根成熟区和伸长区里层细胞直径较野生型均有显著下降。说明OsPDR2在水稻根系发育过程中有重要作用。9.不同供磷水平水培实验结果表明,OsPDR2的沉默影响了水稻体内不同形态磷的平衡和生长后期体内磷的转运与再分配。正常供磷条件下,OsPDR2-RNAi沉默材料老叶叶片中总磷较野生型有所上升,叶鞘、老叶叶片中可提取磷含量较野生型显著上升;老叶叶片中可提取磷占总磷比例较野生型上升60%;OsPDR2-RNAi沉默材料老叶中酸性磷酸酶活性和OsPAPl0的相对表达量较野生型均没有显著差异。说明OsPDR2参与了水稻叶片磷营养平衡过程。收获前后对不同器官中总磷含量的测定发现,OsPDR2-RNAi沉默材料茎杆总磷浓度较野生型上升了 1倍,叶鞘中总磷浓度也有显著上升,说明OsPDR2参与了水稻生长后期磷营养的再分配过程。10.分根实验中,OsPDR2-RNAi沉默材料正常供磷侧吸收磷素向缺磷根系和地上部转运比例较野生型显著提高,说明OsPDR2-RNAi沉默影响了水稻缺磷条件下体内磷素的转运过程;在OsPDR2-RNAi沉默材料缺磷侧根系中OsLPR5的表达量较野生型显著上升,暗示了OsPDR2可能接受体内磷信号调控,并在表达水平对OsLPR5进行负调控。综上所述,OsLPR5和OsPDR2对水稻的生长与发育具有重要作用;OsLPR5在水稻中磷的吸收、转运和分配过程中也具有重要功能;OsPDR2参与了水稻体内磷营养的平衡;OsPDR2负调控OsLPR5对局部磷信号的响应,二者共同参与了水稻对外界缺磷胁迫响应过程。