背景关节软骨缺乏血供,软骨自身修复能力低下,一旦发生缺损,往往导致不可逆性的关节退变。而这种自身修复能力的先天不足,在合并有软骨下骨的复合型缺损时,则显得尤为突出。作为关节软骨的坚强支撑,软骨下骨对关节内的应力传导发挥着重要作用。骨软骨缺损一旦发生,由于失去了坚强的软骨下骨支撑,软骨面局部的应力异常分布及塌陷则难以避免,由此引发的恶性循环将造成正常关节软骨的连锁破坏,最终导致骨性关节炎甚至骨性强直。目前临床上较为成熟的软骨修复技术包括骨髓刺激和移植两大类:前者如软骨下钻孔术和微骨折技术;后者有自体骨软骨镶嵌成型术(Mosaicplasty)和自体软骨细胞移植(ACI)术。但上述技术本身均有其各自的局限性。组织工程学的发展为骨软骨缺损的修复提供了新的思路,复合器官及组织构建是当今组织工程学发展的方向。理想的组织工程化修复应提供软骨及软骨下骨宿主组织的良好结合,已知骨—骨结合远远优于软骨—软骨以及软骨—骨的结合,而理想的组织工程化复合骨软骨,则能够首先满足骨—骨的结合,一期恢复对软骨的力学支撑,并且避免软骨与骨结合不良的问题。组织工程骨和组织工程软骨分别构建成功的报道早已不胜枚举,这也使得骨软骨复合组织构建成为研究者们关注的热点。目前,生物反应器是组织工程领域的研究热点及重要发展方向,其目的在于体外模拟动物机体组织、器官的生理环境,以促进组织的再生。体内正常的骨及软骨组织,其所处生理环境不仅仅限于物理及化学因素,正常的应力刺激是维持关节软骨生理功能的关键。在组织工程学研究中,适当的力学载荷作为一个必要的生理性刺激因素,可以在一定程度上克服传统细胞培养条件的不足。力学因素对于软骨细胞生物学行为的影响过程极其复杂,涉及到细胞类型、形态、生长周期及分布部位等诸多方面。有学者研究表明:流体剪切力可增加矿物质的沉积,增强成骨细胞表型的表达,并使成骨细胞分泌的细胞外基质在支架材料内获得良好的分布。还有研究发现,一定范围的剪切力可促进种子细胞与载体的贴附,并维持成骨细胞在体外的表型。另外,压力负荷可以调节体外构建的组织工程化软骨中细胞的增殖、基质代谢及合成。由生物反应器模拟体内的力学载荷进行组织构建,研究其对于种子细胞的基质合成、形态、力学信号传导机制及电机械性能等,对于以组织工程学方法进行骨软骨损伤的修复具有重要意义。磷酸钙生物陶瓷作为一种优秀的骨组织工程支架材料已被广泛接受,其中应用最多的是羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)。β-TCP具有良好生物相容性和降解性、骨传导能力佳、机械强度适中、微结构和体内降解速率可操控等优点。磷酸钙生物陶瓷在被用作骨支架材料的同时,也已被用于组织工程软骨的构建,已有学者使用β-TCP复合软骨细胞或成软骨诱导的干细胞成功地进行了软骨构建。本研究以山羊BMSCs作为种子细胞,β-TCP生物陶瓷作为组织工程骨及软骨的构建材料。首先进行山羊BMSCs的成骨成软骨方面的诱导,以鉴定其多向诱导分化的能力;进而采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记山羊BMSCs,研究其对山羊BMSCs标记的可行性及其最佳标记浓度和时间,以及对标记对细胞的增殖的影响,为确认下一步山羊体内实验形成的新生软骨组织来源提供研究基础;最后,利用负压抽吸的方法,使山羊BMSCs结合于β-TCP生物陶瓷,设计并制作双腔生物反应器,在其中分别进行成骨诱导分化和成软骨诱导分化;并制作山羊膝关节骨软骨缺损,将在双腔生物反应器中分别诱导2周的β-TCP-细胞复合物移植于山羊膝关节骨软骨缺损部位,观察其对骨软骨缺损的治疗效果,为临床利用自体BMSCs进行组织工程修复骨软骨缺损提供寻找一种新的方法。材料与方法1.山羊BMSCs的分离、培养和鉴定及向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化抽取10月龄健康中国青山羊骨髓,全骨髓培养法培养BMSCs,体外培养至第4代(P4)时行流式细胞术鉴定,并加入成骨诱导培养基和成软骨诱导培养基。成骨诱导培养基成分为:终浓度为100nmol/l地塞米松、10mmol/lβ-磷酸甘油、50ug/ml抗坏血酸的10%FBS高糖DMEM;成软骨诱导培养基成分:终浓度为6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、50ug/ml抗坏血酸、100nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1的10%FBS高糖DMEM。诱导两周后分别行细胞化学染色、免疫细胞化学染色,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹试验(Western blot)检测0、1、2、4周的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达。采用SPSS 13.0统计软件分析,结果用(?)±s表示,p值＜0.05为有统计学差异。第4代和第8代的细胞倍增时间的比较,采用两独立样本t检验;各时间点mRNA和蛋白的相对表达量的比较,应用多个样本均数比较的方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较采用LSD法。2、BrdU体外标记山羊骨髓间充质干细胞的研究利用BrdU标记山羊BMSCs,检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为山羊BMSCs标记示踪方法的可行性。培养山羊BMSCs,取第4代细胞以浓度分别为5、10、15和20gmol/L的BrdU进行标记,分别记为A、B、C、D组;另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组)。分别标记12、24、48和72h后,采用免疫荧光法检测各组细胞阳性率,并用苔盼蓝拒染法测定标记后细胞活率。并观察山羊BMSCs标记后向骨和软骨细胞的分化;使用MTT法检测标记后细胞的增殖能力。细胞阳性标记率和标记前后存活率的均值比较采用析因设计资料的方差分析;细胞标记前、后的细胞倍增时间的比较采用两独立样本的t检验,以P＜0.05为有显著性差异。3、双腔搅拌式生物反应器的制作及组织工程骨软骨修复山羊膝关节缺损的体内研究制作双腔搅拌式生物反应器。取第4代山羊BMSCs,以5×10~7/ml的细胞密度与β-TCP生物陶瓷相复合。在双腔生物反应器中诱导2周后,将BMSCs—β-TCP生物陶瓷复合物植入山羊膝关节缺损区域内。于山羊的双后肢股骨内髁负重区制造直径6mm和深度12mm的缺损,使用外径为6mm的环锯,在负重位置的软骨上钻孔,取出骨和软骨碎屑后,压配方式植入直径6mm,长度12mm的BMSCs—β-TCP生物陶瓷复合物,缺损区域表面用复合山羊BMSCs的1.2%藻酸钠与102mM氯化钙交联形成的凝胶覆盖。根据植入物在生物反应器中是否经力学刺激,将山羊分为三组:A组:力学刺激+双向诱导组;B组:单纯双向诱导组;C组:空白对照组。每组山羊各4只,共12只24个膝关节。术后圈养,不限活动,于术后12周、24周分别处死各组2只山羊。进行如下项目检测:大体观察;组织学及组织化学检测:HE染色;甲苯胺蓝染色;Masson染色,Ⅱ型胶原免疫组化,并观察Brdu的表达。进行O’Driscoll,Keeley and Salter组织形态学评分。评分后的数据以(?)±s表示,应用两因素方差分析,组间比较用LSD法,以P＜0.05为有显著性差异。结果1.原代培养的山羊BMSCs形态呈纺锤状或梭状,折光性好,贴壁生长,随着培养时间延长,细胞呈集落状生长,集落中细胞形态为典型的梭形细胞,并逐渐融合成片。培养7-8d约80%融合,9～10d可形成90%融合的细胞单层。传代细胞大部分为长梭形,细胞生长速度较原代细胞明显增快,潜伏期为2～3d后开始进入对数生长期,7～8d进入平台期。流式细胞术检测细胞表面抗原,可见表达BMSCs标志物CD29,而不表达传代造血干细胞标志物CD34。在成骨细胞诱导分化培养基、成软骨细胞诱导分化培养基的作用下,能分化出成熟的成骨细胞和软骨细胞;2周后分别行成骨细胞鉴定可见碱性磷酸酶染色、茜素红染色呈阳性,行成软骨细胞鉴定可见甲苯胺蓝和阿利新蓝染色阳性。RT-PCR、Western blot及免疫细胞染色结果均证实其向成骨和成软骨细胞的分化。第4代和第8代细胞的形态及生长增殖状况无明显差别(t＝0.342,p＝0.741),并且,在成骨及成软骨诱导2周时,CollagenⅠ、Ⅱ和Aggrecan mRNA和蛋白的表达量与诱导后4周无统计学差异(p＞0.05),与未诱导组及诱导1周组有统计学差异(p＜0.05)。2.第4代山羊BMSCs经BrdU标记后行免疫荧光染色,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。随着标记时间的延长和BrdU剂量的增加,标记率逐渐增高,BrdU终浓度为15μmol/L且标记48h后细胞标记率＞90%,但标记时间继续延长和BrdU浓度继续增加,细胞标记率无明显增高,表明BrdU标记山羊BMSCs的最佳浓度为15μmol/L,最佳标记时间为48h。与正常未标记细胞比较,标记后细胞的形态及生长增殖状况无明显差别(t＝0.178,p＝0.862),活细胞数＞98%。15gmol/LBrdU标记山羊BMSCs48h后不影响向成骨和成软骨细胞分化的能力。3.术后12周取材,A组修复区可见部分软骨样组织,关节软骨无磨损,修复的软骨呈白色半透明外观,与周围正常关节软骨有连续性,可见一明显的凹陷,无明显软骨下骨外露;B组修复区也可见部分软骨样组织,关节软骨在修复区可见磨损,软骨呈白色不透明外观,软骨下骨形成较好;空白对照组术区关节凹陷,无关节软骨组织形成,关节下骨缺如。BrdU免疫荧光证实,新生软骨中部分细胞来源于植入的山羊自体BMSCs。组织学检查示,β-TCP生物陶瓷已基本吸收降解。术后24周取材,见A组山羊手术区关节表面较为光滑,与周边正常软骨自然连续平齐,透明的新生软骨组织形成,软骨下骨形成完好;B组山羊手术区修复的软骨组织基本完整,中心部位仍未完全融合,有微小凹陷;Ⅱ型胶原免疫组化示新生软骨组织呈棕黄色。C组术区关节凹陷,无关节软骨组织形成。A组和B组,软骨下骨的生长及与周围组织的结合均较好,无植入物脱落现象的发生。组织学检测结果显示:A组在山羊体内形成的软骨质量优于B组,O’DriscollKeeley and Salter组织形态学评分为:A组12周(n＝4)16.00±0.816,24周(n＝4)18.75±0.957;B组(n＝4)12周11.00±0.816,24周(n＝4)14.75±0.957;C组未形成软骨,12周及24周时各组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1、髂骨骨髓穿刺可分离出BMSCs。全骨髓培养法培养的BMSCs生长至第4代时,纯度较高,活力旺盛。本实验证明,山羊BMSCs具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能,并且其在成骨和成软骨诱导培养基中培养2周时,其可表达成骨和成软骨的标志。山羊BMSCs来源丰富、取材容易,创伤小,是理想的组织工程种子细胞,具有广阔的应用前景。2、BrdU标记山羊BMSCs的最佳时间为48小时;最佳终浓度为15μmol/L;标记阳性率＞90%。BrdU对细胞无毒副作用,安全性高,对细胞的生长增殖及成骨、成软骨分化无明显影响。3、利用双腔搅拌式生物反应器,以山羊BMSCs为种子细胞,在同一块β-TCP生物陶瓷上可同时构建组织工程化骨和软骨。山羊体内实验证明,在生物反应器中进行体外培养时,力学刺激有利于改善山羊关节软骨的形成质量。