论文部分内容阅读
目的 强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种以异常成骨和炎症为特征的自身免疫性疾病,以中轴关节病变为主,随着疾病的进展,关节正常结构和功能逐渐丢失,严重者脊柱活动功能完全丧失。本研究通过建立正常人和AS疾病模型的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),将其向间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)诱导分化,观察正常人和AS iPS-MSCs成骨分化的差异,探索其可能的分子机制,然后采用白芍总苷干预AS iPS-MSCs成骨分化,探索白芍总苷对AS iPS-MSCs成骨的作用及机制,为中药治疗AS提供理论依据。方法 第一部分:收集正常人及AS患者的尿液获取尿液细胞后,通过核转仪将pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、pCXLE-EGFP、pCXWB-EBNA1质粒核转进入尿液细胞,在MEF上共培养后获取iPSCs克隆,挑取iPSCs单克隆进行扩增后对其形态、内外源基因的表达、表面标志物及多能分化潜能进行鉴定。第二部分:将iPSCs以直接贴壁的方法将其向MSCs诱导,通过多次传代获取形态一致的成纤维样细胞,将获取的细胞向成骨、成脂、成软骨分化,鉴定细胞三系分化的能力,同时采用流式细胞术分析CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105的表达情况,从而验证诱导获取的细胞是否符合MSCs的诊断标准。第三部分:将正常iPS-MSCs和AS iPS-MSCs向成骨诱导,观察两者之间的成骨差异,检测成骨指标、自噬指标及β-catenin基因及蛋白表达情况,采用自噬抑制药物6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)及β-catenin 促进药物(SKL2001)干预细胞,观察成骨、自噬及β-catenin的改变。第四部分:采用白芍总苷干预AS iPS-MSCs的成骨,观察干预后成骨、自噬指标及β-catenin基因及蛋白表达情况,在此基础上增加自噬促进药物的干预,观察干预后成骨、自噬指标及β-catenin基因及蛋白表达的改变。结果 第一部分:产生的iPSCs细胞在MEF上培养形态与ESCs相似:细胞为圆形,排列紧致,呈现为与周围MEF细胞边缘清晰的集落状。正常iPSCs与AS iPSCs细胞RT-PCR结果显示内源KLF、MYC、NANOG、OCT4、SOX2基因在两株细胞中均表达升高,而pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、pCXLE-EGFP 外源性质粒的基因在两株细胞中不表达,表明通过核转进入的基因未与自身基因发生整合。正常iPSCs与AS iPSCs两株细胞免疫荧光结果显示均能表达OCT4和NANOG全能性特异性蛋白,并且同时表达了 ESCs特异性表面抗原TRA-1-60、SSEA4。正常iPSCs与AS iPSCs的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色结果显示所有细胞均表现为ALP高表达,提示两株细胞均未分化,具有强增殖潜能。正常iPSCs与AS iPSCs体外拟胚体自主分化结果显示,细胞在体外能自主形成拟胚体;正常iPSCs与AS iPSCs体内畸胎瘤病理切片结果显示具有代表内胚层的肠道上皮结构、代表中胚层的软骨结构和代表外胚层的神经花环及视网膜色素上皮结构。染色体核型分析显示iPSCs与AS iPSCs染色体数量和结构正常,未出现缺失。第二部分:iPSCs在MSCs诱导培养基诱导传代后细胞呈现一致的成纤维样形态。iPS-MSCs成骨诱导后可见茜素红染色和ALP染色阳性,表明诱导后iPS-MSCs有钙结节的形成和碱性磷酸酶的表达;成脂诱导后油红O染色细胞内可见油滴形成;成软骨的聚集体培养可见软骨聚集体形成,病理切片阿利新蓝染色显示聚集体内有胶原形成。为了鉴定iPS-MSCs的表面标志,本研究采用流式细胞分析术检测了细胞表面分子的表达情况,其中CD73、CD90、CD 105在诱导获得的细胞表面均为阳性表达,而CD 14、CD34、CD45阴性表达,这符合MSCs表面标志物的鉴定标准。第三部分:正常iPS-MSCs与AS iPS-MSCs 24h、48h和72h CCK8检测显示两者之间无明显差异。将正常iPS-MSCs与AS iPS-MSCs向成骨诱导分化14d后,AS iPS-MSCs茜素红染色、ALP染色颜色、茜素红量、ALP活性水平要高于正常iPS-MSCs。对诱导14d 的 iPS-MSCs 的基因及蛋白进行检测,AS iPS-MSCs 的 MAP1LC3B(LC3)、OCN、COL1A1、CTNNB1(β-catenin)基因的表达水平高于正常 iPS-MSCs,而 SQSTM1(P62)基因的表达低于正常iPS-MSCs;并且AS iPS-MSCs的OCN、COL1A1、非磷酸化β-catenin蛋白表达及LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值高于正常iPS-MSCs,P62蛋白表达水平低于正常iPS-MSCs,在采用自噬抑制剂3-MA进行干扰后,正常iPS-MSCs与AS iPS-MSCs茜素红染色、ALP染色颜色、ALP活性水平减弱,MAP1LC3B(LC3)、OCN、COL1A1基因的表达水平及OCN、COL1A1蛋白表达、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值下降,而SQSTM1(P62)基因表达及P62蛋白表达水平升高,正常iPS-MSCs与AS iPS-MSCs之间比较无明显差异,这表明AS iPS-MSCs内自噬水平的升高促进了其成骨能力;同时我们也检测到非磷酸化β-catenin蛋白及CTNNB1基因表达水平也出现了下降,这提示自噬很可能调节β-catenin基因的表达及蛋白的活化水平。为了进一步证实自噬是否是通过诱导β-catenin的活化导致AS iPS-MSCs成骨能力的增加,我们采用Wnt/β-catenin信号通路的激动剂SKL2001进行干预,发现在成骨诱导14d后,SKL2001促进自噬抑制的AS iPS-MSCs的成骨分化,其茜素红染色及定量分析、ALP染色、ALP活性水平均较自噬抑制的AS iPS-MSCs升高,OCN、COL1A1、CTNNB1基因的表达水平及OCN、COL1A1、非磷酸化β-catenin蛋白表达也升高,而MAP1LC3B(LC3)、SQSTM1(P62)、LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白比值和P62蛋白水平的比较无差异,但是SKL2001干预后成骨能力并不能恢复至无干预AS iPS-MSCs的水平,这提示自噬很可能部分通过促进了 β-catenin活化促进了 AS iPS-MSCs的成骨分化。第四部分:为了评估白芍总苷干预AS iPS-MSCs的合适使用浓度,本研究采用62.5ug/mL、125ug/mL、250ug/mL、500ug/mL 白芍总苷使用浓度培养细胞,发现 250ug/mL、500ug/mL浓度的白芍总苷对AS iPS-MSCs增殖抑制比较明显,而62.5ug/mL、125ug/mL浓度的白芍总苷对增殖干预的影响较小,故本研究选取62.5ug/mL、125ug/mL白芍总苷干预AS iPS-MSCs的成骨分化。根据白芍总苷对细胞增殖能力的影响,本研究采用对照组(无药物)、62.5ug/mL、125ug/mL白芍总苷药物浓度干预AS iPS-MSCs的成骨分化,干预14d后观察到125ug/mL的白芍总苷在成骨茜素红染色及定量分析、ALP染色、ALP活性明显减少;对自噬、成骨及β-catenin检测发现125ug/mL白芍总苷干预的AS iPS-MSCs 中 MAP1LC3B(LC3)、OCN、COL1A1、CTNNB1 基因表达水平降低,LC3Ⅱ/Ⅰ、OCN、COL1A1、非磷酸化β-catenin蛋白表达水平低于对照组:SQSTM1(P62)基因及P62蛋白水平高于对照组。为了观察白芍总苷是否是通过自噬影响了成骨,我们采用自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin,RA)0.2μM干预,分为对照组、125μg/mL白芍总苷干预组及RA+125μg/mL白芍总苷组,对其诱导成骨14d,观察到RA恢复了白芍总苷干预AS iPS-MSCs的成骨分化能力,其自噬水平、成骨基因及蛋白较白芍总苷干预升高,而P62基因及蛋白水平降低,这证明了白芍总苷是通过抑制自噬从而起到抑制AS iPS-MSCs成骨分化能力。结论 本研究能成功将AS患者来源的尿液细胞诱导分化为AS疾病模型的iPSCs细胞系,并能将其向MSCs诱导。AS iPS-MSCs相比正常iPS-MSCs展现出更强的成骨能力,成骨过程中AS iPS-MSCs具有更高的自噬水平,诱导了活化β-catenin的升高,这导致了 AS iPS-MSCs更强的成骨分化能力。白芍总苷可以通过抑制AS iPS-MSCs成骨分化过程中的自噬水平,减少活化β-catenin,从而降低了 AS iPS-MSCs的成骨分化能力。