热带假丝酵母立体选择性羰基还原酶的分离及性质研究

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(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯是用于治疗注意缺陷多动障碍(ADHD)药物托莫西汀的关键手性中间体。2003年上市的盐酸托莫西汀(Atomoxetine hydrochloride,ATX)是目前唯一获美国FDA批准可用于ADHD儿童、青少年与成人患者的非神经系统兴奋药物。从土壤中筛选得到一株能够高效还原β-羰基苯丙酸乙酯生成(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的菌株,对映体过剩值高达100%。经26S rDNA序列分析鉴定,该菌株属于假丝酵母属,命名为热带假丝酵母Candida tropicalis zjut 412。通过单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Benhnken实验,对C.tropicalis zjut 412的发酵培养条件进行优化,得到了最佳培养条件:葡萄糖浓度为43 g/L、装液量为27 mL、培养时间为43 h。C.tropicalis zjut 412的比活力由初始的894.4 U/g提高到1388.66 U/g,比活力提高了55.3%。通过单因素实验对C.tropicalis zjut 412的转化条件进行优化,得到了最优的反应条件为:以8%葡萄糖为辅助底物,pH为6.0,底物浓度为4.8 g/L,生物量为92 g/L(干重/反应体积),反应温度为35℃,反应时间为24 h时转化率及对映体过剩值均可达到100%。采用超声波细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、DEAE sepharose FF阴离子交换层析和Blue sepharose 6FF亲和层析对C.tropicalis zjut 412中的羰基还原酶进行分离纯化。羰基还原酶的比活力由初始的0.049U/mg提高到6.77 U/mg,纯化倍数为139,回收率为12%。研究了酵母C.tropicalis zjut 412中羰基还原酶的酶学性质。其在35℃时的催化能力最强,大于40℃时酶蛋白迅速变性失活。其催化还原反应的最适pH为6.0,酶蛋白仅在pH7.0至8.5之间较为稳定。EDTA的加入对酶活的影响不明显,可认为该酶在催化反应中并不需要金属离子的参与。Ca2+、Mg2+和Mn2+离子对酶活性的发挥具有促进作用。
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