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随着工业的水平提高,世界资源及能源逐步枯竭和短缺,能源与环境问题成为人类生存发展的严峻挑战。太阳能是地球上非常重要的能源,生物质资源作为固定化太阳能,是地球上最丰富的碳源。各国都致力于开发生物质能源,其中,木质纤维在生物质能源中占50%,理论上可以作为重要的清洁可再生资源。但是,纤维素结构致密,不易溶解,结晶区等问题导致其不易被降解利用,成为纤维素研究的瓶颈。而现有的物理、化学方法破坏结晶区能耗大,污染环境,不符合可持续发展的需要。因此,研究高效降解纤维素的微生物菌株具有重要意义。哈氏噬纤维菌Cytophaga hutchinsonii是广泛分布于土壤中属拟杆菌门的革兰氏阴性菌,能快速,彻底的降解纤维素。但是其既不分泌游离的纤维素酶,又不存在纤维小体结构,推测有独特的纤维素降解机制,目前对C.hut的降解机制了解甚少。C.hut中很多基因可能编码纤维素酶,其中有3个GH5家族的内切纤维素酶,6个GH9家族的内切纤维素酶和4个GH3家族的β-葡萄糖苷酶。其中,β-葡萄糖苷酶,是水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖,在纤维素的降解速率中起到关键性的调控作用,是纤维素降解中必需酶。深入研究β-葡萄糖苷酶,对提高纤维素的降解效率,及阐明C.hut独特的纤维素降解机制都有重要的意义。在C.hut中,GH3家族的4个β-葡萄糖苷酶分别是CHU2268（BglA）,CHU3784,CHU2273（BglB）,CHU3577（BglC）。本实验室之前的研究发现BglA是β-*葡萄糖苷酶,而且又是可以降解纤维寡糖的纤维寡糖酶。BglB是噬冷型β-葡萄糖苷酶,而CHU-3784没有活性,CHU-3784可能是个假基因。本文就BglC进行重点研究,围绕β-葡萄糖苷酶的基因鉴定、克隆、异源表达、酶学性质及定点突变等方面做了一系列的研究,主要包括以下几个内容:1.BglC生物信息学分析和异源表达。BglC基因长度为2253bp,编码751个氨基酸,有一个GH3保守结构域,NCBI中注释为GH3家族的β-葡萄糖苷酶（E-value值为4.95e-158）。Signal P预测CHU3577不含信号肽序列,无跨膜结构,PSORTb预测蛋白位于胞内。将BglC基因与pMAL-C2X质粒连接在E.coli DH5α中,提取质粒后导入E.coli JM109中,诱导后获得了高效表达的重组β-葡萄糖苷酶。2.BglC的生化性质。BglC以β-pNPG为底物,对其生化性质研究,发现其最适反应温度为42℃,最适pH为6.5,在低温下稳定性好,耐热性差。各金属离子对Bg]C酶活性的影响,发现Mg2+,Mn2+,Fe3+在终浓度为10mM以前,随着离子浓度的增加酶活增加,随后趋于平稳。其中,Mg2+的作用最强。Ca2+浓度对酶活影响不大。Ni2+和Cu2+对酶活有抑制作用。有机溶剂对酶活性的影响中发现,甲醇,乙醇,丙酮,正丁醇,乙酸乙酯对酶活均具有抑制作用。BglC酶活对葡萄糖度耐受度比较高,在葡萄糖浓度是β-pNPG浓度的100倍时仍保留60%的活性。3.BglC水解底物的多样性。除了具有β-葡萄糖苷酶的性质外,BglC既可以水解昆布二糖的β-1,3糖苷键、纤维二糖的β-1,4糖苷键,而且同时都能发生转糖基作用。而对于麦芽糖,异麦芽糖,α-pNPG,龙胆二糖,蜜二糖,松二糖,杏仁苷,BglC则没有水解和转糖基作用。以纤维二糖或者β-pNPG为底物时,其水解活力几乎相当。BglC能水解纤维二糖,三糖,四糖,五糖,并均能发生转糖基作用。对葡萄糖无转糖基作用发生。4.以纤维二糖为底物时,对于转糖基的效果,在低于45℃效率几乎相同,高于45℃效率降低。在pH为弱酸性条件下转糖基效率高,弱碱性条件下几乎无转糖基发生,和以β-pNPG为底物时水解的酶活条件一致。BglC在转糖基能力方面,以纤维二糖为底物时,有机溶剂甲醇乙醇浓度为20%时仍有转糖基作用发生。说明以纤维二糖为底物时有机溶剂对发生转糖基作用的耐受性相对高。当葡萄糖浓度是纤维二糖底物浓度的10倍时,水解活力是原来的90%左右,但是其转糖基能力几乎丧失,猜测水解和转糖基不是可逆反应。5.对BglC氨基酸位点定点突变。BglC的三维结构与来自大麦的外切水解酶1EX1|A相似度比较高,在35%以上。经过序列对比后定点突变,其中D303A,E513A 是活性中心。发现以β-pNPG 为底物时,W443A,I336M,D122A,M268A,E188A/R,K224A,R185A/V,S271A,D303A,K309F,E513A,突变后均无水解活力。猜测以上位点对BglC酶的催化活性至关重要。I336L,I336S,K309T,F171L,F171M,S271Y,水解活力均有不同程度的降低。S82A是原来活力的116%,I83A是原来活力的130%,I336A是原来水解活力的120%。以上位点可能参与酶的催化反应。对于1336位点,突变为I336M后无酶活,I336L,I336S酶活降低,I336A酶活升高。说明对1336同一位点不同的氨基酸对酶活影响不同。此结果与BglC以纤维二糖为底物时水解活力结果基本一致。说明以上位点的改变影响酶活。以β-pNPG为底物时,对葡萄糖的耐受性变化不大的是I336A,F171M,S82A。而I83A,K309T,I336S,I336L位点的突变对葡萄糖的耐受性降低,以上位点可能与葡萄糖的耐受性相关。其中I83A突变后酶活升高,而葡萄糖耐受性下降,说明酶活与葡萄糖耐受性不是正相关。