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大肠杆菌O157是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga-producing Escherichia coli, STEC)的主要血清型,可以引起人和动物的腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜。志贺毒素(Shiga toxin,Stxs)是大肠杆菌O157的主要毒力因子之一,有两个生物型:Stx1和Stx2,只产生Stx2的菌株毒力比只分泌Stx1和两者同时分泌的菌株毒力都强。Stx2致病剂量极低,且分泌胞外,Stx2的检测将直接有助于对分离菌株致病力强弱的判定,提高对高致病性大肠杆菌O157菌株的检出。因此本课题研究大肠杆菌O157和Stx2的胶体金层析法(Gold Immunochromatography Assay, GICA),进行高致病性大肠杆菌O157菌株检测和鉴定,以便更好的预防和控制大肠杆菌O157所致的人和动物的疾病。将本实验室构建的重组Stx2B亚单位的质粒pGEX-Stx2B转化入大肠杆菌BL21,然后采用PCR和酶切进行鉴定,将阳性转化菌进行重组蛋白的表达、鉴定、纯化,用纯化的融合蛋白多次免疫新西兰大白兔制备抗重组Stx2B的多克隆抗体。同时用大肠杆菌O157 ATCC43889全菌体抗原多次免疫新西兰大白兔,制备抗大肠杆菌O157多克隆抗体。用硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、Protein G亲和层析3种方法分别纯化制备的多克隆抗体,结果表明:Protein G法纯化的抗重组Stx2B IgG纯度较其前两者纯,其金标多抗的稳定性较好,辛酸-硫酸胺法纯化的抗大肠杆菌O157 IgG的活性较Protein G纯化的好,其金标多抗的稳定性较好,因此本试验采用Protein G法纯化抗Stx2B血清,用辛酸-硫酸胺法纯化抗大肠杆菌O157血清。根据试纸条的侧向流动和胶体金的示踪功能,结合免疫学原理,分别建立并优化了检测大肠杆菌O157和Stx2的双抗体夹心免疫胶体金方法。测定了胶体金颗粒的最优化反应体系:胶体金颗粒的大小为20nm;抗体与胶体金溶液结合的最佳pH约为8.2;最佳蛋白结合量分别为抗大肠杆菌O157 IgG为57μg/mL,抗重组Stx2B IgG为60μg/mL;最佳稳定剂为BSA;最佳缓冲液为pH8.2硼酸溶液;最佳金标保存液和洗涤液为5mM NaCl-1%BSA的pH 8.2的硼酸缓冲液;NC膜的封闭液为3%BSA的0.01mol/L PBST;Stx2试纸条和大肠杆菌O157试纸条的质控线(C线)上的羊抗兔IgG的多克隆抗体最佳点样量均为1μg,其检测线(T线)的抗Stx2的单克隆抗体的点样量为0.1μg、抗大肠杆菌O157的单克隆抗体的点样量为1μg,结合垫上的金标抗大肠杆菌O157和重组Stx2B多克隆抗体点样量均为3μg。用已建立的大肠杆菌O157免疫层析法对实验室保存的58株已鉴定的菌株进行检测,与血清凝集实验结果相比较,其阳性检出率的符合率达87.5%,检测下限为105CFU/mL,显色时间为3～5分钟,阳性检出率的批内平均变异系数为2.1%,阳性检出率的批间平均变异系数为6.9%。用已建立的Stx2免疫层析法对实验室保存的58株已鉴定的菌株进行检测,与Vero细胞毒性实验相比较,其阳性检出率的符合率为50%,显色时间为5～10分钟,阳性检出率的批内平均变异系数为2.6%,阳性检出率的批间平均变异系数为28.85%。大肠杆菌O157试纸条的特异性、重复性和敏感性较好,大肠杆菌O157免疫胶体金试纸条转化为商用试纸条是可行的。Stx2免疫胶体金试纸条在抗体效价、敏感性方面还需进一步优化,以提高阳性检出率和重复性。