【摘 要】
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β-防御素属抗菌肽，因具有广谱抗微生物和免疫增强作用以及对病原微生物不易产生抗性等优点而成为当前生物医学的研究热点之一。
为探讨鸡β-防御素在原核表达系统中的高
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β-防御素属抗菌肽，因具有广谱抗微生物和免疫增强作用以及对病原微生物不易产生抗性等优点而成为当前生物医学的研究热点之一。
为探讨鸡β-防御素在原核表达系统中的高效表达机制及其抗菌活性。本研究以鸡β-防御素-8（Gallinacin-8，Gal-8）为研究对象，运用分子生物学技术，从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出Gal-8基因片段，并构建pGEM-T Easy-Gal-8克隆载体、pGEX-6P-1-Gal-8大肠杆菌表达载体和pN28048-Gal-8乳酸菌表达载体。诱导表达了融合蛋白GST-Gal-8，经亲和层析纯化获得了Gal-8，并对纯化产物的生物活性进行了初步研究。具体内容和结果如下：
1．Gal-8 cDNA的克隆。
参考GenBank注册的鸡β-防御素cDNA序列（DQ677639），设计三对引物P1/P2、P3/P4和P5/P6，P1/P2扩增Gal-8全基因片段，P3/P4和P5/P6扩增编码成熟肽基因。提取三黄鸡总RNA用随机引物逆转录合成cDNA第一链，运用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），从安徽三黄鸡肝脏组织中克隆出目的基因，对PCR产物进行纯化回收，构建pGEM-T Easy-Gal-8克隆载体。提取重组克隆质粒并测序，经GenBankBLAST程序比对显示：获得的安徽三黄鸡Gal-8基因共201个碱基同源性达99％，其中在第111位有一碱基变异；分析Gal-8编码框分别由20个氨基酸的信号肽、5个氨基酸的原片段、41个氨基酸的成熟肽组成。以pGEM-T Easy-Gal-8质粒为模板，分别用P3/P4和P5/P6为引物PCR扩增了Gal-8成熟肽基因片段。
2．Gal-8成熟肽基因在大肠杆菌中的表达。
用引物P3/P4PCR扩增的Gal-8成熟肽基因和pGEX-6P-1载体双酶切后连接，构建pGEX-6P-1-Gal-8表达载体并转化大肠杆菌BL21。阳性转化子经IPTG诱导表达后，融合蛋白用SDS-PAGE鉴定。结果表明，表达的GST-Gal-8融合蛋白分子量约为30kD，可存在于上清和沉淀中。表达重组子在25℃经0.5mmoL IPTG诱导4h后可溶性融合蛋白得到最佳表达。融合蛋白在上清中的表达量占菌体总蛋白的19.1％，达到0.2921mg/mL。融合蛋白上清液用谷胱甘肽．琼脂糖树脂柱亲和层析纯化，获得了鸡β-防御素Gal-8成熟肽。单层琼脂平板扩散法检测表达产物体外生物活性，表明Gal-8成熟肽对黄色微球菌有一定的抗菌活性。
3．Gal-8成熟肽基因在乳酸菌中的表达。
用引物P5/P6PCR扩增的Gal-8成熟肽基因和pN28048载体双酶切后连接，构建pN28048-Gal-8表达载体并转化乳酸菌Lacotcoccus lactis N29000。阳性转化子经鉴定后用Nisin诱导表达，用Tricine-SDS-PAGE鉴定。结果未检测到目的条带，有待Western bloting进一步鉴定。
以上研究成功从鸡组织中克隆了Gal-8基因片段，构建了Gal-8克隆载体和Gal-8成熟肽基因的大肠杆菌表达载体及乳酸菌表达载体，大肠杆菌转化子经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-Gal-8，经亲和层析纯化获得了Gal-8成熟肽，并初步探讨了纯化蛋白的抗菌活性。乳酸菌转化子经nisin诱导表达未检测到目的条带。研究结果为鸡β-防御素的抗菌活性及其理化特性的深入研究奠定了基础。
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