细菌素BM1157对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究

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细菌素是由细菌核糖体合成的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质,其主要对同源或近缘的微生物具有抑制作用。近年来细菌素因其抑菌性、安全和不易产生耐药性等特点被广泛研究,以求日后其能成为天然的食品防腐剂及抗生素的替代物。而细菌素BM1157作为课题组在面包乳杆菌MN047中发现的新型细菌素,在先前的研究中已经发现其具有广谱抗菌活性。在本研究中,在大肠杆菌中对BM1157进行了异源表达,并对其进行了纯化鉴定、性质及机制的表征以及对其分子作用机制进行了初步研究。得到的结论主要有:(1)以pET-30a(+)质粒作为表达载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为宿主菌成功异源表达了细菌素BM1157,双层牛津杯平板法对表达制备的BM1157粗样进行抑菌能力检测发现其具有良好的抑菌能力。(2)BM1157粗样经透析、超滤、AKTA纯化系统中使用阳离子SPFF柱分离、反相液相色谱一系列纯化步骤之后并经液质鉴定之后后得到鉴定到的氨基酸残基覆盖率为98.18%,BM1157的所有序列除起始密码子编码的甲硫氨酸均被覆盖。并经傅里叶红外变换光谱测定得知其具有一定的α-螺旋及β折叠转角结构。(3)BM1157细胞毒性极低,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌都具有良好的的抑菌活性。为探索BM1157的抑菌机制,随后进行了胞外DNA释放量的测定以及膜电位变化测定,结果显示BM1157对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜无破坏作用。随后通过荧光实时定量PCR测定发现BM1157抑制大肠杆菌的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核糖转运及膜蛋白的表达等过程,并且显著降低了转录调节因子RNA聚合酶σ因子的基因表达水平。而对于金黄色葡萄球菌,BM1157能够抑制其的肽聚糖合成及磷壁酸生物合成,抑制DNA复制与修复过程,抑制细胞周期。DNA结合实验结果显示BM1157能结合金黄色葡萄球菌的DNA,但对大肠杆菌的DNA无影响。(4)为了获得BM1157分子作用机制的靶点信息,通过突变筛选获得了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的BM1157抗性菌株,并对两株野生菌株和两株抗性菌株进行了全基因组测序并获得四株菌的全基因组信息(其中大肠杆菌野生菌株全基因组序列全长为4750508 bp,大肠杆菌BM1157抗性菌株全基因组序列全长为5108639 bp;金黄色葡萄球菌野生菌株全基因组序列全长为2777619 bp,金黄色葡萄球菌BM1157抗性菌株全基因组序列全长为2777010 bp)。随后将分别对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的野生菌株和抗性菌株的全基因组进行了比较基因组分析,分析结果显示BM1157抗性菌相对于野生菌株存在大量的差异基因(325个),根据这些基因的功能进行分析,认为BM1157对E.coli可能存在多重抑菌机制。而不同于E.coli,S.aureus的差异基因只有6个,经过分析认为BM1157可能会改变S.aureus因粘附和α-毒素引起的致病性,并且其作用靶点可能为黄酮代谢过程中的查尔酮异构酶及细胞呼吸过程中的细胞色素氧化酶装配蛋白。综上所述,细菌素BM1157具有良好的广谱抗菌活性,并且细胞毒性极低,且其存在多重抑菌机制,不易产生耐药性,在天然食品防腐剂及抗生素替代物的应用方面具有极大潜在价值。
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