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研究背景支气管哮喘(哮喘)是一种以可逆性气流受限和气道高反应性为显著特征的慢性呼吸道炎症性疾病。目前研究普遍表明,气道重塑是发生可逆性气流受限以及气道高反应性的病理结构基础。随着疾病进展,气道重塑不断加重使支气管哮喘患者对常规的治疗药物及治疗方案的反应性不断降低,在某些哮喘患者中甚至出现药物抵抗。在以上过程中,气道平滑肌细胞(airwaysmoothmusclecell,ASMC)增生以及肥大等变化被认为是气道重塑主要作用机制。转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)-β 1/Smad 信号通路是气道平滑肌细胞参与哮喘发病机制的重要信号转导通路,其与气道平滑肌细胞增殖及蛋白表达息息相关。在Smad蛋白家族中,虽然Smad2和Smad3结构十分相似,但是Smad3蛋白中的某部分氨基酸结构可以直接与DNA序列结合,以调节基因的转录,即Smad3蛋白可以参与TGF-β 1引起的靶基因调节作用。白细胞介素(Interleukin,IL)-33被认为哮喘易感,并且能够在鼻病毒诱发的支气管哮喘加重过程中起到关键作用。先前的研究表明,气道平滑肌细胞可以分泌IL-33,IL-33与TGF-β 1/Smad3信号通路的相关性研究,目前尚未报道。国内外研究表明,1,25-(OH)2D3(又称骨化三醇)可以减轻体内及体外条件下的气道重塑,并且其影响气道平滑肌细胞的具体机制仍在研究。基于国内外最新研究,我们推测TGF-β1可通过TGF-β1/Smad3信号通路刺激气道平滑肌细胞表达IL-33,从而促进哮喘中的炎症反应;骨化三醇可协同布地奈德,更有效抑制气道炎症和气道重塑,发挥其治疗哮喘的作用。并对此进行课题研究,旨在发现哮喘新的治疗靶点。研究目的1.通过用不同浓度TGF-β 1培养基培养小鼠气道平滑肌细胞,探究不同浓度TGF-β 1对气道平滑肌细胞表达分泌IL-33的影响;2.采用TGF-β 1/Smad3信号通路阻断剂(SIS3)干预,观察干预TGF-β 1/Smad3信号通路后对气道平滑肌细胞表达分泌IL-33的影响;3.研究骨化三醇协同布地奈德对支气管哮喘的治疗作用及可能存在的作用机制。研究方法1.将小鼠气道平滑肌细胞分成不同浓度[0ng/mL(空白)、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL]TGF-β 1组,获取细胞培养上清液和总蛋白,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组上清液中IL-33的浓度,采用Western blotting法检测各组细胞IL-33的蛋白表达情况。2.加入TGF-β 1/Smad3信路阻断剂(SIS3)处理小鼠气道平滑肌细胞,分为空白组、预处理TGF-β 1组、未预处理SIS3组和预处理SIS3组,采用ELISA法检测各组上清液中IL-33浓度,采用Western blotting法检测各组Smad3、pSmad3及IL-33蛋白表达情况。3.将小鼠气道平滑肌细胞分为空白组、TGF-β 1组、SIS3组、布地奈德组、骨化三醇组、药物共处理组,采用ELISA法检测各组上清液中IL-33浓度,采用Western blotting法检测各组Smad3、pSmad3及IL-33蛋白表达情况。研究结果1.ELISA表明,不同浓度TGF-β 1刺激小鼠气道平滑肌细胞后,细胞培养上清液中的IL-33浓度不同;10ng/mL TGF-β 1作用效果最佳,1 ng/mL TGF-β 1和100 ng/mL TGF-β 1的作用效果没有显著差异。同时,Westernblotting显示,不同浓度TGF-β 1刺激小鼠气道平滑肌细胞后,各组细胞不同程度表达IL-33;10ng/mL TGF-β 1组细胞IL-33蛋白表达量最高。2.加入SIS3后,通过ELISA检测各组细胞培养上清中IL-33的浓度,结果表明,与预处理TGF-β 1组比较,预处理SIS3组细胞培养上清液中IL-33的浓度明显减少。Westernblotting表明,在加入SIS3后,TGF-β 1/Smad3信号通路受到抑制,Smad3蛋白磷酸化水平下降,Smad3蛋白、pSmad3蛋白表达减少,IL-33蛋白表达也明显减少。3.药物处理各组小鼠气道平滑肌细胞后,ELISA显示,布地奈德组较骨化三醇组细胞培养上清液中IL-33浓度更低,且药物共处理组IL-33浓度低于各单独用药组。Westernblotting显示,药物共处理组的Smad3蛋白、pSmad3蛋白、IL-33蛋白表达水平出现明显降低的趋势。研究结论①不同浓度TGF-β 1刺激气道平滑肌细胞不同程度表达分泌IL-33,说明IL-33与TGF-β 1具有相关性。10ng/ml TGF-β 1为该作用的最佳浓度。②TGF-β 1/Smad3信号通路可调节气道平滑肌细胞表达分泌IL-33,在气道平滑肌细胞参与哮喘发病机制中发挥重要作用。③骨化三醇联合布地奈德可通过TGF-β 1/Smad3信号通路有效抑制小鼠气道平滑肌细胞表达分泌IL-33,抑制气道炎症,从而治疗哮喘。