背景:肺移植是治疗终末期肺部疾病的一种有效手段。按照国际心肺移植联盟2010年的统计报告，每年施行的肺移植例数超过了2700例，总体1年和5年生存率约为79%和52%，与其他实体器官移植相比，疗效仍有待提高。此外，肺移植后一系列复杂的免疫和非免疫过程，人们仍远未完全理解，建立各种肺移植模型对以上问题进行研究有望制定新的治疗性或者预防性的解决策略。动物原位肺移植模型是临床肺移植的模拟，其术后排斥反应、感染和缺血再灌注损伤的研究能为后者提供有用的信息。截至目前，已经建立了包括狗、猪、羊、鼠等多种动物在内的动物模型，其中，第一例大鼠肺移植见于1971年，之后Mizuta的cuff技术和其他一些改良方法极大地优化了该模型，更重要的是，因费用较低，容易获得特定的近交品系，大鼠原位肺移植受到较多的关注。目的：对既有的应用cuff技术的大鼠原位单肺移植模型进行进一步的优化方法：采用改良的cuff技术进行了39例大鼠肺移植，具体的改良措施包括：1：供、受体动物均接受经口气管插管术，为了避免插管过程中的声带损伤，选择16G的静脉留置针套管作为气管导管；2：整个cuff为无尾设计，在置入时可以夹持其任何部位。此外，在距离一端0.2mm的地方制作凹槽，以方便固定打结，防止脱落；3：保留受体左肺并将之向外牵拉以方便暴露和吻合，吻合结束后予以切除；4：在受体步骤中，对肺门结构不做彻底的解剖，仅于肺动脉、支气管和肺静脉间做保守性的游离，制作两个隧道供吻合。管壁周围的软组织予以保留以对抗张力，预防撕裂伤；5：按支气管、肺静脉和肺动脉的顺序依次进行吻合；6：单人操作，无需助手帮助，不借助特殊器材。结果：80只大鼠均接受了经口气管插管术，77例成功，成功率96.25%，余3只插管失败后改行气管切开术。39例左侧原位肺移植中1例受体在术中因窒息死亡，余38例均进展顺利。受体除了在机械通气开始时和肺门阻断后有一过性的低血压外，术中基本平稳，波动于100±15mmHg。两次低血压在短暂辅助呼吸和肺门开放后均恢复正常。心电监护提示术中心电平稳，无心律失常发生。全部cuff植入均一次成功，无血管或者气管的扭曲、撕裂伤或渗漏发生。全部移植物通气及血流灌注良好，手术时间持续63.4±16.1分。一只动物在术后8.5小时死于呼吸衰竭，1例动物术后10天亡于消耗。结论：大鼠原位肺移植模型可以通过改良的cuff技术顺利地完成。改良后的程序能够有效地缩短手术时间，减少并发症，提高成功率，在大鼠肺移植模型中具有良好的应用前景。背景：对于移植病理师而言，肺移植术后排斥反应的诊断存在较多的困难和争议，其中，较为公认的标准是经支气管肺穿刺活检及病理，该结果被广泛应用于肺脏排斥反应的诊断、监测和随访，当临床上怀疑有排斥存在时，参照该结果来制定、修改相应的治疗方案是一个较为合理的选择。通常而言，那些活检病理阳性的患者对免疫治疗的反应良好，不过，奇怪的是，一些活检阴性的患者同样可以在免疫治疗中受益，经过糖皮质激素的强化治疗后这些患者的临床症状能得到明显的缓解或改善。导致该现象的原因目前尚不十分清楚，但在一定程度上预示着可能有隐性的未被诊断的排斥反应存在。因此，寻找一种可靠的方法来对移植肺的排斥反应进行准确诊断具有重要的临床意义。目前为止，活检组织中环血管的单个核细胞浸润被认为是肺排斥反应的特征性改变，世界上几乎所有的移植中心均参考该标准来指导肺移植后药物治疗。根据血管周围单个核细胞浸润强度和肺组织的破坏程度，移植肺组织的排斥反应可以人为地分为四级，不过，遗憾的是，不同的医师对以上分级的解释和理解存在较多的差异，一些主观或者客观的因素均可能导致诊断上的误差，即便来自同一中心的不同病理学家对活检切片的诠释也存在较大的差异，诊断符合率介于中等与一般之间。这提示着在肺移植排斥的诊断过程中存在较多的不精确性和不定因素。已知同种移植后的排斥反应是一个复杂的病理生理过程，在该过程中T淋巴细胞的募集和活化会导致移植物的损伤和失功能。因此，对肺移植物内浸润的淋巴细胞进行定性、定量分析可能有助于术后排斥反应的监测和治疗。考虑到常规HE染色提供的诊断信息有限，借助一些特殊染色如组织化学、免疫组化和原位杂交技术等所提供的额外信息也有望提高诊断的准确率。目的：研究同种异体大鼠肺移植术后移植肺的病理变化，评价免疫组化在诊断排斥反应中的作用。方法：按改良的大鼠左肺移植模型共施行肺移植术90例，其中近交系肺移植30例，非近交系肺移植60例。受体大鼠按照实验设计分别在术后不同的时间点被处死，移植肺组织被固定、包埋、切片后染色，行HE和IHC检查。结果：除4例手术失败者外，余86例标本中发生完全性肺不张或者毁损肺37例，主要集中在远交系或者封闭群肺移植者（p=0.006），且随着时间的延长而增多（p=0.017），近交系肺移植发生肺不张6例，与时间无关（p=0.926）。近交系肺移植的大鼠肺组织HE染色显示，术后3天存在轻度的肺损伤，表现为肺泡的渗出、间隔的水肿和间质的浸润。7天后以上病变基本消失，肺损伤组织学评分明显低于术后3天（3.57±0.98vs0.86±0.69，p=0.000）。大体观，非近交系肺移植者，移植肺内出现不同程度的灶状/片状不张病灶以及出血性、水肿或者渗出性病变，随时间而逐渐加重。近交系肺移植者移植肺接近正常肺组织，通气及血流灌注良好。镜下观，可以看到与临床肺移植术后相类似的不同程度的典型排斥反应，分别相当于国际心肺移植联盟推荐标准中的A、B、C、D型排斥反应及其不同亚型。组织切片经免疫组化染色后，染色阳性的淋巴细胞极大地便利了排斥反应的诊断和分级，部分排斥反应级别因此得到了修正，两次诊断的符合率为71.95%，整体加权kw值为0.648，p=0.000。随着排斥反应的增强，间质内浸润的淋巴细胞逐渐增多，活动组肺内淋巴细胞数量明显多于稳定组（p﹤0.01）。结论：大鼠原位肺移植术后可以模拟临床移植肺的排斥反应，免疫组化对肺排斥反应的诊断有辅助作用。背景：较多的证据表明，肺移植能使部分终末期肺部疾患患者的生存受益。按照国际心肺移植联盟2010年的报告，在世界范围内每年有超过2700例患者接受肺移植，1年、3年、5年和10年生存率分别为79%、63%、52%和29%。值得关注的是，术后一年是肺移植后最为关键的一年，期间有约21%的患者亡于术后意外、合并的基础性疾病以及急性排斥反应。此外，以小气道进行性纤维性破坏为特点的闭塞性细支气管炎（obliterative bronchiolitis,OB）严重影响患者术后的生活质量，是肺移植术后移植物失功能的首位原因。据统计，移植后存活时间超过3个月的患者中约半数会发生该并发症，并且，较多的证据表明，慢性排斥和急性排斥关系密切，后者是导致闭塞性细支气管炎的高危因素，多次发生的急性排斥或者一次较高级别的急性排斥，均与OB密切相关，甚至有人认为，OB本身就是反复发作的急性排斥的结果。因此，预防、减轻或者积极有效的治疗肺移植术后的排斥反应具有重要的临床意义。目前为止，免疫抑制剂构成了肺移植术后抗排斥的基础性药物，尽管联合使用钙神经素抑制剂、抗代谢药物、糖皮质激素以及mTOR抑制剂有效地改善了肺移植术后的预后，其相对低效、固有的副反应以及相关的并发症极大地限制了移植后的治疗效果。Tregs是一些具有调节属性的T细胞，在发挥自我耐受和保持免疫稳态方面具有重要作用，同时又与免疫抑制剂有别，使得接受治疗的受体在保持对移植组织耐受的同时仍能发挥对其他各种病原的完整免疫反应。因此，Tregs正在成为移植术后一项颇具前景的治疗策略。目前为止，已经发现了多种具有调节作用的Tregs，并且，多项研究均证实了其在临床和实验性移植领域的可行性和重要性。但是，对于肺移植术后的耐受与何种Treg有关，其具体机制如何仍有待积极探索。目的：探讨CD8+Tregs对大鼠肺移植后急性排斥反应的调节作用及免疫耐受机制。方法：Lewis大鼠按实验设计分别接受了同种肺移植、同基因肺移植和假手术处理并在术后不同的时间点被处死。HE染色了解术后移植肺组织的病理变化；Western Blot比较不同组别间移植肺组织内Foxp3和FR4的表达；离心法、裂解法或者研磨法获取外周血、移植物、区域淋巴结、脾脏和支气管肺泡灌洗液内淋巴细胞，荧光标记抗体染色后行流式细胞术检查,比较不同组别T细胞表型和Foxp3表达的差异。结果：同种移植的肺组织内可以观察到典型的急性排斥反应，而同基因移植或者对照组的肺组织基本正常。蛋白印迹提示，移植后肺组织内Foxp3的表达增高，术后7天其在同基因移植者高于A1,A2级排斥反应但与A3、A4级相当。肺移植后血液和肺组织内淋巴细胞增多，以CD8+T增多为主，CD4+/CD8+<1并随排斥强度的增加而下降。无论是在血液还是肺组织内，均顺利地检测到了一群表达CD8、CD25和Foxp3的T细胞，且同基因移植肺组织内高于同种移植者。依CD45RC表达强度不同，T淋巴细胞可以分为CD45RC+和CD45RC-两个亚群,同基因肺移植和对照组中CD45RC+和/CD45RC-的比值低于同种移植者。比较不同组别间CD8+CD45RC-Treg的表达，对照组和同基因移植者的肺组织和区域淋巴结中，其占CD8或CD3的比例高于同种移植着，而在血液和脾脏内差别不大。进一步分析显示，随着术后时间的延长和排斥强度的增加，CD8+CD45RC-Treg的数量呈下降趋势。另外，在同基因移植大鼠的支气管肺泡灌洗液内，CD8+CD45RC-/CD3+高于异基因移植者。结论：Lewis大鼠体内至少存在两种具有免疫调节作用的CD8+Tregs，即：CD8+CD25+Foxp3+Treg和CD8+CD45RC-Treg，在肺移植后，这些调节性T细胞通过直接或者间接途径参与了肺保护过程，与移植耐受有关。