一、Par3促进结直肠癌侵袭与转移背景与目的细胞极性是上皮细胞发挥其生理功能和各种生物发育所必需的,它参与细胞分化,增殖和形态发生的过程。在哺乳动物中,上皮细胞极性功能失调引起癌细胞的侵袭和转移。Par3（partition defective protein 3）是一种细胞极性蛋白,能与Par6（Partition defective protein 6）和aPKC（atypical protein kinase C）组成PAR复合物,并通过与JAM的相互作用被锚定于细胞膜,在上皮细胞顶-底极性的建立和紧密连接的形成以及上皮细胞的增殖与迁移中具有重要作用。最近的研究表明Par3在肿瘤进展和转移中具有重要作用。在乳腺癌中,Par3的缺失通过抑制E-钙粘蛋白连接稳定性和损害细胞-细胞凝聚力促进癌细胞侵袭和肿瘤转移。此外,Par3的下调可通过14-3-3ζ蛋白促进肺腺癌细胞增殖和转移。然而在前列腺癌中,Par3表达增高可通过hippo通路的失活促进前列腺癌的转移和侵袭。在人肝细胞癌中,Par3表达增高与癌细胞转移和较差的存活率显著相关。因此,Par3可以在不同类型肿瘤中具有促进或抑制肿瘤生成以及侵袭转移的作用。结直肠癌（CRC）作为胃肠外科常见的癌症类型,也是全球癌症相关死亡的常见原因,每年约有136万新病例,接近694 000例死亡。约40%左右的结直肠癌患者会在疾病过程中发生转移,无法切除的转移性疾病患者5年生存率低于10%。在本研究中,我们旨在确定Par3在结直肠癌转移中的可能作用,并研究可能与临床结果相关的Par3相关通路。研究方法1.在常规病理检查后,从手术室获取51名患者的结肠直肠肿瘤和正常组织样本。采用Western-blot,RT-qPCR和免疫组化方法检测Par3的表达。2.通过shRNA在HCT116细胞中敲除Par3,Western-blot和RT-qPCR分析用于检测Par3,E-钙粘蛋白的表达。进行菌落形成实验以检测Par3对CRC细胞生长的影响。进行细胞迁移和侵袭测定以检测Par3在CRC细胞的转移中的作用3.为了确定Par3促进CRC细胞生长和转移的机制,我们检查了潜在的下游信号传导途径。进行蛋白质印迹以确定Par3敲低对STAT3,ERK1/2和JNK的影响。研究结果1.RT-qPCR和Western blot结果表明CRC肿瘤中Par3的表达增高。免疫组化结果同样显示Par3在结直肠癌中表达是增高的,且Par3在结直肠癌腺窝部位表达增高。我们对51例患者的Par3表达水平与临床资料进行了相关分析,结果表明Par3的表达增高与年龄较大（≥50岁）和分化较差显著相关。2.RT-qPCR和Western blot结果表明,使用shRNA沉默Par3可有效地抑制CRC细胞中Par3表达。此外,Par3的沉默可诱导CRC细胞中E-钙粘蛋白的表达显著增加。3.细胞集落形成实验结果显示,在结直肠癌细胞HCT116中沉默Par3的表达可诱导集落形成的细胞数显著减少,提示Par3具有致瘤潜力,可促进CRC细胞的细胞增殖。同时细胞迁移实验和细胞侵袭实验结果显示,沉默Par3的表达,显著抑制CRC细胞的迁移和侵袭能力。4.Western blot结果显示Par3沉默可抑制STAT3的活化。表明STAT3信号通路可能参与Par3对CRC细胞增殖和转移调节。结论在本研究中,我们发现Par3在CRC肿瘤中表达增高,而Par3的表达增高与年龄较大（≥50岁）和分化较差显著相关。细胞集落形成实验结果表明Par3具有致瘤潜力,可促进CRC细胞的细胞增殖。细胞迁移实验和细胞侵袭实验结果表明Par3可促进CRC细胞的迁移和侵袭。Par3沉默可抑制STAT3的活化,STAT3信号通路可能参与Par3对CRC细胞增殖和转移调节。二、Ah R活化保护肠屏障功能的机制研究肠上皮屏障（intestinal epithelial barrier,IEB）承担着抵御病原入侵、维持机体内环境稳态的关键性角色。由肠上皮细胞（intestinal epithelial cell,IEC）组成的机械屏障是IEB功能的结构基础,其主要由IEC和相邻细胞之间的连接构成。其中以紧密连接（tight junction,TJ）最为重要。紧密连接封闭了细胞顶部的细胞间隙,阻挡了肠腔内的有害物质及肠道菌群进入机体。多种因素所致的IEB功能损害均伴有TJ蛋白表达异常和完整性的破坏。炎症性肠病（IBD）是胃肠道的慢性非特异性炎性病症,包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。大量研究表明,TJ功能障碍在IBD的病理过程中起着不可或缺的作用。孔道形成蛋白Claudin-2是TJ蛋白Claudins家族成员之一,其表达增加可显著破坏肠道TJ屏障功能。例如IBD患者的结肠上皮中观察到Claudin-2的表达上调。白细胞介素-6（IL-6）是一种多效细胞因子,具有多种促炎作用。IL-6在IBD的发病机制中发挥重要作用。最近的证据表明,IL-6通过诱导claudin-2的表达来调节肠上皮屏障功能。芳香烃受体（Ah R）是一种依赖配体激活的转录因子。芳香烃受体以配体依赖的方式进入道细胞核,然后与Ah R Nuclear Translocator（ARNT）形成异源二聚体,再特异性与Ah R反应元件（Ah REs）结合,活化之后可以诱导多种细胞因子的表达。6-Formylindolo（3,2-b）carbazole（FICZ）是Ah R最有效的天然活化剂之一。研究表明,FICZ诱导的Ah R激活可以抑制胃肠道炎症。本课题通过IBD小鼠模型及两种体外细胞模型,采用RT-q PCR,Western blotting,跨膜电阻测量,免疫荧光,免疫组化等技术,研究Ah R活化减轻IBD肠道炎症及缓解IL-6诱导的肠粘膜损伤的分子机制。研究方法1.建立DSS诱导的小鼠结肠炎模型,给予小鼠FICZ腹腔注射处理,组织学检查结肠组织的炎症状况,RT-q PCR检测IL-6的表达变化,免疫组化检测Claudin-2的表达。Ussing Chamber检测结肠跨上皮电阻等。观察Ah R对结肠炎的影响。2.建立两种肠上皮细胞系IL-6干预模型,给予si RNA干扰Ah R处理、FICZ处理后,采用RT-q PCR、Western blot、免疫荧光等技术检测Claudin-2、CYP1A1的表达,探讨Ah R活化缓解结肠炎炎症的机制。探讨Ah R缓解结肠炎的机制。3.建立肠上皮细胞系IL-6干预模型,给予si RNA干扰HNF-1α和CDX-2处理、FICZ处理,用Western blotting检测HNF-1α和CDX-2、claudin-2等的表达变化,探讨Ah R活化在维持肠粘膜屏障功能方面的具体机制。研究结果1.FICZ改善DSS诱导的结肠炎小鼠模型中的结肠炎症:组织学检查显示用FICZ治疗的小鼠发生不太严重的结肠炎,用FICZ处理的小鼠IL-6水平降低。2.FICZ下调Claudin-2表达并在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中维持肠屏障功能:FICZ阻止了DSS引起的TER下降,FICZ可以阻止DSS诱导的Claudin-2 m RNA和蛋白质表达的增加,免疫组织化学染色结果显示施用FICZ后,与DSS处理组相比,Claudin-2显著下调。3.FICZ改善IL-6诱导的肠屏障功能障碍并减少体外Claudin-2的表达:FICZ改善了IL-6在Caco-2单层中诱导的TER的减少;免疫荧光结果显示IL-6增强了Caco-2细胞单层的连接区域中Claudin-2的强度,在FICZ处理后,Claudin-2的表达显著降低。4.Ah R的沉默阻止了FICZ诱导的Claudin-2的下调:在IL-6处理后,Claudin-2的表达增加,并且FICZ诱导的Ah R激活抑制IL-6诱导的Claudin-2的增加。然而,Ah R si RNA处理显著阻断了FICZ的作用。5.FNZ诱导Ah R激活后,HNF-1α和CDX-2参与了Claudin-2的调控:HNF-1α或CDX-2的沉默抑制IL-6诱导的Claudin-2的上调;在DSS诱导的结肠炎小鼠中HNF-1α和CDX-2的表达也增加,并且施用FICZ抑制HNF-1α和CDX-2的上调。结论在注射FICZ的小鼠中,Claudin-2表达降低并且TER显著增加。该发现表明FICZ诱导的Ah R活化维持DSS诱导的结肠炎中的肠屏障功能。TER、免疫组化染色的结果表明,FICZ下调Claudin-2表达并在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中维持肠屏障功能。通过建立肠上皮细胞系IL-6干预模型研究表明FICZ改善IL-6诱导的肠屏障功能障碍并减少体外Claudin-2的表达。给予si RNA干扰Ah R处理,Ah R的沉默阻止了FICZ诱导的Claudin-2的下调。给予si RNA干扰HNF-1α和CDX-2处理,FICZ诱导Ah R激活后,HNF-1α和CDX-2参与了Claudin-2的调控。