蛋白磷酸化修饰是生物体内最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式。磷酸化通过改变蛋白质的构象、活性及蛋白-蛋白相互作用,对信号传导、基因表达、细胞分裂等生物学过程发挥重要的调控功能,而且与肿瘤的发生和发展密切相关。但是,总的来说,对于磷酸化的研究集中于O-磷酸化。一些研究表明N-磷酸化修饰在生命过程中同样发挥着重要的作用,比如,组氨酸的磷酸化在响应外界刺激的“双组分系统”中扮演重要角色,精氨酸磷酸化是一种原核生物中蛋白质降解的标签。但总体来说,N-磷酸化的研究大大落后于O-磷酸化,究其原因,在于N-磷酸化的酸、热敏感性。这种区别于O-磷酸化的不稳定性一方面与现有的蛋白质分析流程不兼容,另一方面给特异性的富集材料的开发增加了困难。研究手段的匮乏导致对细胞内N-磷酸化蛋白质的数量、种类和时空分布没有全面认识,相关的激酶、酯酶发现甚少,N-磷酸化对蛋白质功能的调控和具体的生物学功能也尚不清楚。因此开发针对N-磷酸化的研究工具是一项基础而紧迫的科学任务。事实上,近年来几乎所有该领域的突破性进展都建立在工具的成功开发和方法的优化创新上。本论文的工作就是围绕着这一方向而展开。具体包括:1.稳定类似物的合成和性质表征。合成表征了 pHis和pArg的稳定类似物,探究了化合物的带电性质,应用质谱定量证明了磷酸化化合物可以被细胞摄取,为后续的生物实验奠定基础。2.N-磷酸化抗体开发。建立了一整套N-磷酸化抗体的制备、表征和应用方法,成功开发出高亲和力和高专一性的单抗和多抗,并且应用于各种生化表征实验中,揭示了 pHis和pArg在真核细胞中的广泛存在性。3.评价稳定类似物对组氨酸醋酶的抑制作用。基于上述pHis抗体开发了一种检测组氨酸酯酶（PHPT1）活性的方法,应用于表征类似物对PHPT1的体外抑制能力;考察了类似物对肺癌细胞的增殖和迁移的影响,并且初步揭示出该影响与PHPT1活性的关系。4.人类细胞中的N-磷酸化蛋白和位点的鉴定。基于优化的N-磷酸化组学流程,在Jurkat细胞株中鉴定到N-磷酸化的广泛存在,揭示出N-磷酸化蛋白在核酸相关功能中可能扮演的重要角色,发现N-磷酸化序列具有特定的结构域。同时将上述开发的抗体成功应用于对质谱鉴定到的蛋白的验证。总之,着眼于N-磷酸化的不稳定性,本论文开发了高效的研究工具和研究流程,并且初步在真核细胞中鉴定到了大量的N-磷酸化位点,为后续的大规模的鉴定实验和生物功能研究奠定了基础。