肠球菌属于乳酸菌,是人和动物肠道及部分食品的重要微生物菌群,它能够产生称为肠球菌素的抗菌肽。由于肠球菌产生的细菌素不仅能够抑制与其相关的菌群还能够抑制革兰氏阳性致病菌和食源致病菌,因此,它们有望应用在动物饲料添加剂和天然食品保鲜剂中。本研究拟从我室分离保存的具有益生特性的肠球菌中,进一步筛选产细菌素的细菌素菌株,并对其细菌素抑菌特性研究,为开发新型微生态制剂提供理论依据。通过对屎肠球菌HDRsEfl抑菌谱的测定确定金黄色葡萄球菌作为指示菌。琼脂覆盖试验显示,11株试验菌株中有5株菌肠球菌有明显的抑菌效果,结合PCR技术对常见的肠球菌素基因进行检测,最终筛选出两株产EnterocinL50的肠球菌分别为屎肠球菌Wsg09和粪肠球菌T-12。产细菌素肠球菌的生长曲线、pH和抑菌圈曲线显示,菌株生长迅速,产酸,培养30h时细菌素活性达到最大。从产细菌素菌株的野生质粒上成功扩增到了entL50基因,证明该细菌素是由质粒DNA编码,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上,构建克隆质粒pMD-L50测序分析,与登录号FJ618564.1的基因序列同源性达到100%。运用生物信息学方法分析了蛋白相关特性和结构的预测,EnterocinL50是由A和B两个小肽组成,均具有与靶细胞膜互作的重要特征即呈阳离子特性,有高度的α螺旋结构。为促进足量的EnterocinL50产生和便于其纯化,我们选用大肠杆菌异源表达系统进行重组蛋白的大量表达。将两个重组原核表达质粒pET28a-L50A和pET28a-L50B分别转入大肠杆菌BL21中,并在大肠杆菌中成功表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白His-Ent.L50A及在分子伴侣作用下诱导产生的His-Ent.L50B均为可溶性。利用亲和层析从细胞裂解产物上清中纯化His-Ent.L50A和His-Ent.L50B。纯化产物抑菌活性检测结果显示His-Ent.L50A和.B具有协同作用,对单增李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用,MIC和MBC结果证明His-Ent.L50作用模式为抑菌,并且具有剂量依赖性。抑菌谱结果显示His-Ent.L50对单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、乳酸菌和部分的芽孢杆菌有抑制作用,但对大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里氏杆菌无拮抗活性。