中国老年人外周血单核细胞中骨质疏松症潜在蛋白标志物的筛选与验证　　第一部分　　骨质疏松症（OP）在世界范围内都是一种主要的公共卫生问题，骨质疏松性骨折（OF）因为高致残率和高致死率的特点被认为是OP最严重的的结局。迄今， OP/OF的病理学机制仍然是未明的。骨密度（BMD）是被广泛用来诊断 OP 的金标准，外周血单核细胞（PBM）能分化形成破骨细胞并在骨表面附着吸收骨。近年来，差异表达的蛋白质组学研究方法被运用来鉴定与疾病相关的蛋白标志物。基于这个想法，我们设计了这项从中国老年男性PBM中鉴定OP潜在的蛋白标志物并探究其分子机制的研究，该研究主要可以分成三章：第一章，基于定量蛋白质组学Label-Free的方法，我们从中国老年男性的PBM样本中系统地筛选OP潜在的蛋白标志物；第二章，我们运用蛋白质免疫印迹技术（WB）验证第一章质谱方法筛选出的蛋白在PBM水平各组间的表达情况并观察目的蛋白在血浆中的表达情况是否与样本的髋部BMD相关；第三章，我们通过体外的细胞实验观察在不同浓度目的蛋白的培养条件下成骨细胞的活性变化。　　研究目的：　　运用定量蛋白质组学Label-Free技术，我们从中国老年男性的PBM样本中系统地筛选潜在的OP蛋白标志物；针对初步筛选出来的OP蛋白标志物，我们运用WB技术验证目的蛋白在男性的PBM样本的各亚组间差异表达并观察其在血浆样本中的表达是否与样本髋部BMD相关；选出多次实验验证、证据充分的易感蛋白，通过体外实验观察不同浓度易感蛋白如何影响成骨细胞活性并探究易感蛋白与OP之间的分子功能机制。　　研究方法：　　我们招募了18个髋部OF（年龄均值77岁）的病人和18个年龄、性别匹配无骨折史的样本（年龄均值73岁，简写为NF）构成了男性PBM样本。NF样本是由一半极高 BMD 人群和一半极低 BMD 人群构成的（髋部 Z 值： -1.06 vs.+1.36）。男性PBM样本中所有的个体均为中国老年男性。另外一个独立的女性PBM样本是由27例髋部OF的病人（年龄均值78岁）和24例身高、年龄匹配的健康对照（年龄均值70岁）构成的。女性PBM样本 中的NF对照也是由一半极高BMD人群和一半极低BMD人群构成的（髋部Z值： -1.30 vs.+1.34）。女性PBM样本中所有的个体为中国老年女性。PBM首先从外周血中分离，总蛋白也随即从中获得。全蛋白质组学的蛋白表达谱通过 Label-Free 定量蛋白质组学方法获得（Easy-nLC1000 and Q-exactive, Thermo）。蛋白质组学的数据由 Maxquant 和Perseus软件处理后获得，我们按照表达倍数改变（fold change[FC]）大于两倍，P值小于0.05的标准分别从极端高、低骨密度组间和骨折、非骨折组间筛选鉴定出蛋白并定义为差异表达蛋白（DEP）。生物信息学分析，包括基因本体数据库（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）、蛋白质与蛋白质交互作用分析（PPI）被用来对DEP进行功能注释。　　酶联免疫吸附实验（ELISA）中所有的研究样本都是汉族的中国老年男性。首先，运用ELISA方法检测血浆S100A9蛋白在20例OF病人和64例NF样本的表达情况。64 例 NF 样本是由一半极低 BMD 人群和一半极高 BMD 人群构成的(0.72±0.04 vs. 1.12±0.05 g/cm2)。我们运用t检验的方法分别分析血浆S100A9蛋白在 OF/NF 组间和 L/H 组间表达差异。同样我们运用 ELISA 的方法初次检测血浆ABI1蛋白在20例OF病人和64例NF样本的表达情况。ABI1蛋白ELISA实验中所使用的20例OF病人与S100A9蛋白ELISA实验所涉及到的OF样本是同一批，但是ABI1蛋白ELISA实验中所使用到的64例极端高低BMD样本与S100A9的样本有所区别(0.67±0.03 vs. 1.18±0.06 g/cm2)；第二次ABI1蛋白ELISA实验是在38例低BMD人群和37例高BMD人群中测试的(0.72±0.04 vs. 1.11±0.04 g/cm2)，血浆ABI1蛋白在OF/NF组间和L/H组间表达差异也是用相同的统计方法分析获得的。此外，我们通过WB技术运用目的蛋白特异性的抗体来观察男性PBM样本中PBM水平目的蛋白在各亚组间的表达差异。　　人类胎儿成骨细胞系（hFOB1.19）作为成骨细胞前体细胞，在严格的培养条件下能分化成为成熟的成骨细胞。我们在hFOB的培养基中加入人类ABI1重组蛋白，形成0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0ng/ml梯度的ABI1蛋白浓度。我们利用RTCA S16仪器实时监测并记录36小时内hFOB细胞在不同浓度ABI1蛋白刺激下细胞指数（CI）的变化。我们运用PE Annexin V凋亡试剂盒观察ABI1蛋白刺激下hFOB细胞的凋亡。实时荧光定量PCR被用来观察不同ABI1蛋白浓度刺激下成骨相关指标碱性磷酸酶（ALP）、一型胶原蛋白 A1（COL1A1）、骨桥蛋白（OPN）的表达水平。体外的ALP染色被用来观察成骨细胞分化的活性。　　研究结果：　　我们在高低骨密度组间共鉴定到15个DEPs，这些DEPs主要富集的生物过程有：“肌动蛋白骨架组织”(P=0.004)，“正调节Ⅰ-kappB 激酶/核因子-kappa B 级联”(P=0.005)，“正调节肥大细胞分化”(P=0.009)，并且主要富集在趋化因子信号通路上(KEGG ID 04062)。此外，我们在男性PBM样本的骨折与非骨折样本中鉴定到36个DEPs，这些DEPs主要富集的生物过程有：“生物附着”(P=4.38E-7)，“细胞运动性”(P=1.02E-6)，“细胞迁移”(P=0.003)，“趋化性”(P=0.007)。在男性PBM样本中，ABI1 蛋白在低骨密度组较高骨密度组表达下调（FC=0.82,P=0.043），相同的下调趋势在OF样本中也能观察到(FC=0.73,P=0.008)。S100A9位于交互作用网络的中央并与多个 DEPs 相互作用，该蛋白在低骨密度组较高骨密度组表达上调(FC=1.28,P=0.027)，相同的上调趋势在OF样本中也能观察到(FC=3.58, P=0.014)。ABI1和S100A9蛋白在女性PBM样本各组间的表达调控趋势与男性PBM样本中基本相同。　　在 PBM 水平，S100A9 蛋白在低 BMD 组较高 BMD 组表达上调（FC=1.28, P=0.027），OF组较NF组表达也是上调(FC=3.58, p=0.01)。但是该上调趋势在血浆样本中并没有验证得到。在 PBM 水平，ABI1 蛋白在低骨密度组较高骨密度组表达下调（FC=0.82, P=0.043），OF组较NF组表达也是下调(FC=0.73, P=0.007)。相同的下调趋势在血浆水平的 OF/NF 组间(OF vs. NF : 0.41 vs. 1.03 ng/ml,FC=0.39,P=0.039)和L/H (L vs. H:0.5 vs. 1.57ng/ml, FC=0.39,P=0.0012) 组间也观察得到；再次独立样本ELISA实验验证也能观察到ABI1蛋白在低BMD组表达下调的趋势L/H (L vs. H:0.86 vs. 1.23ng/ml, FC=0.70,P=0.0036)。在WB实验中，校正了内参GAPDH的表达量后，我们发现男性PBM样本的PBM蛋白样本中ABI1在OF和低骨密度组的表达较高骨密度组表达下调。　　与未加ABI1蛋白的空白对照组相比，不同浓度的ABI1蛋白均能促进成骨细胞的生长(0.5-4.0ng/ml)，其中以2.0ng/ml浓度的促进作用最为显著，但是8.0ng/ml的浓度显示过高并明显地抑制了成骨细胞的生长。细胞凋亡实验提示体外ABI1 蛋白的刺激不会影响成骨细胞的凋亡。实时荧光定量 PCR 实验结果显示，2.0ng/ml和 0.5ng/ml 的 ABI1 蛋白浓度，前者能明显促进成骨相关基因(ALP, COL1A1, OPN,P<0.05)的表达水平；同时通过体外的 ALP 染色实验我们也发现 2.0ng/ml 和0.5ng/ml的ABI1蛋白浓度相比，前者的蛋白浓度刺激能明显促进成骨细胞的体外分化水平。　　研究结论：　　我们设计了此项研究尝试从中国老年男性的PBM样本中鉴定新的OP相关的标志物，结果显示 ABI1 蛋白通过调节成骨基因的表达，影响成骨细胞的生长、分化和活性，从而影响人群的BMD值和OF，ABI1蛋白是OP潜在的蛋白标志物。　　第二部分Anxa2抑制成骨细胞生长与中国老人髋骨密度和骨质疏松性骨折相关　　研究目的：　　本研究目的在于1）观察PBM样本中Anxa2蛋白表达是否在OF病人与NF对照人群有显著差异；2）观察血浆Anxa2蛋白与髋部BMD是否相关3）观察体外不同浓度的Anxa2蛋白刺激如何影响成骨细胞的活性。　　研究方法：　　所有的研究样本均为中国汉族老年人。首先，我们运用 LC-MS/MS 方法在45例OF病人和42例健康对照的PBM样本中鉴定并定量Anxa2蛋白的表达。其次，我们运用ELISA方法检测并比较血浆Anxa2蛋白在极端高、低骨密度样本中的表达(0.63±0.10 vs. 1.05±0.10 g/cm2, n=75)。我们开展了体外的细胞实验观察Anxa2蛋白刺激对成骨细胞生长的影响。　　研究结果：　　我们发现 PBM 中 Anxa2 蛋白表达水平在 OF 病人组显著高于 NF 对照组（FC=1.16，P<0.05）。血浆Anxa2蛋白水平（31.69-227.35ng/ml）在极端低BMD人群中显著高于极端高BMD人群 (84.85 vs. 66.15ng/ml,FC=1.28,P<0.05)。成骨细胞生长动态监测记录证明Anxa2蛋白刺激作用呈现为浓度依赖的反U型曲线，具体表现为，低剂量的 Anxa2 蛋白能促进成骨细胞的生长，最适的刺激浓度为50ng/ml，但是过高的蛋白浓度（>50ng/ml）会减弱成骨前体细胞hFOB1.19的生长。　　研究结论：　　Anxa2蛋白减弱成骨细胞的生长且与中国老年人的髋部BMD和OF相关。