本试验通过两种研究思路研究β-折叠抗菌肽结构与功能关系,探讨其生物学活性和抑菌机理。第一个思路是设计抗菌肽。首先从抗菌肽的氨基酸组成及结构特点出发,设计了一系列全新的β-发卡抗菌肽,通过疏水性残基缬氨酸(V)和阳离子残基精氨酸(R)的交替连接形成p-发卡结构的两条侧链,D-脯氨酸(DP)和甘氨酸(G)形成p-转角单元以及侧链末端的两个半胱氨酸(C)连接形成一个二硫键,来设计得到全新的p-发卡抗菌肽(AC-C(VR)nDPG(RV)nC-NH2, n=1、2、3、4和5),探讨发卡抗菌肽片层长度与生物学活性之间的关系。其次,为了进一步验证片层长度对发卡肽生物学活性的影响。截取猪源抗菌肽protegrin-1(PG-1)的β-转角氨基酸序列,分别用4个具有代表性的氨基酸：脂肪族氨基酸异亮氨酸(Ⅰ)、芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)、杂环氨基酸色氨酸(W)和杂环亚氨基酸脯氨酸(P)与R交替连接延长PG-1转角两端片层,设计得到了XR系列肽(XR)nH(RX)n-NH2,(n=1,2;X为I、F、W和P：H为CRRRFC),探讨不同结构来源的疏水性氨基酸与精氨酸构成的片层延长结构对其功能的影响。第二个思路是改造天然抗菌肽鸡p-防御素-4(AvBD4)。截取不同长度的AvBD4的羧基末端,用异亮氨酸替代其截取衍生物一级结构中的半胱氨酸,提高肽的疏水性,观察肽的生物学活性的变化。在前期研究基础上,进一步对AvBD4羧基末端的短肽进行改造。通过氨基酸替代的方法替换AvBD4羧基末端短肽的不同位置的氨基酸,逐渐提高正电荷数量,以探讨电荷数量对抗菌肽生物学活性的影响。通过体外试验,计算治疗指数,筛选出具有最佳细胞选择性的抗菌肽。检测抗菌肽与模拟膜、细菌细胞膜以及DNA分子的作用,对抗菌肽的作用机理进行了初步的探索,并对筛选出来的较为理想的抗菌肽通过毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)进行真核表达。主要研究结果如下：(1)在一系列β-发卡抗菌肽VR1、VR2、VR3、VR4及VR5中,随着发卡片层长度的增加,抑菌活性先升高后降低,呈二次曲线关系,而细胞毒性也随片层长度的增加而提高。VR3展示出最强的抗菌活性和最低的细胞毒性,具有较高的细胞选择性。(2)随着XR系列肽片层长度的提高,抑菌活性和细胞毒性均有增大的趋势。含有脂肪族氨基酸Ⅰ的IR2具有最大的细胞选择性。(3)线性AvBD4(RL38)具有较高的杀菌活性,并且不同长度的截取肽GL23、GL18及GL13仍然具有杀菌活性,但有不同程度的降低,尤其对S. Pullorum C79-13几乎丧失杀菌活性。用异亮氨酸(Ⅰ)替代GL23、GL18及GL13分子中的半胱氨酸(C)得到衍生物GLI23、 GLI18及GLI13对S. Pullorum C79-13杀菌活性均提高,并接近RL38的杀菌浓度(LC)值。通过氨基酸残基替换提高GLI13的正电荷数量,当肽的电荷提高至5时,GLI13-5具有最高的杀菌活性,进一步提高电荷并没有导致杀菌活性提高。值得注意的是,GUI13-6、GLI13-7和GLI13-8对S. Pullorum C79-13的杀菌活性依次减小。RL38的最小溶血浓度为16uM,通过截取及氨基酸替代RL38的羧基末端获得的一系列衍生物的最小溶血浓度均大于128uM。综合以上结果,发现GLI23和GLI13-5的治疗指数较高,具有较大的细胞选择性。(4)通过对抗菌肽的稳定性分析表明,VR3、IR2、GLI23和GLI13-5在经过不同盐离子、蛋白酶及高热处理后仍然具有不同程度的抑菌活性；通过CD谱对抗菌肽的二级结构进行分析,发现全新设计的p-发卡抗菌肽在磷酸钠的水环境、模拟微生物膜的疏水环境(50%TFE)和模拟带负电荷的原核细胞膜环境(30mM SDS)中均表现出一定的折叠和发卡结构。XR系列肽在水溶液中为无规则卷曲结构,在TFE(α-螺旋)和SDS(p-折叠)溶液中分别表现出不同的二级结构。AvBD4衍生物在水环境中多是无规则卷曲结构,而在模拟疏水环境和膜环境中均发生构象的转变,除了RL38和GLI13-5表现出一定的折叠构象,其他衍生物大多都富含α-螺旋结构。(5)对β-发卡抗菌肽VR3进行了小鼠的体内抑菌试验,通过构建小鼠的脓毒症(sepsis)模型,发现三个抗菌肽处理组(1.25、2.5和5mg/kg)的小鼠在7天内的死亡率分别为86%、43%、和29%。两个高剂量组在24h后小鼠腹腔中的菌落数由对照组的109cfu/mL降到了106cfu/mL,表明抗菌肽VR3在体内仍然能够明显抑制由沙门氏菌感染所致的脓毒症,并表现出剂量效应。(6)根据细胞膜组分不同,分别使用PE/PG(7：3,w/w)和PC/cholesterol (10:1, w/w)来模拟细菌和真核细胞的细胞膜,通过抗菌肽固有的内分子标记物色氨酸进行荧光光谱分析,发现处于PE/PG磷脂环境中的抗菌肽产生了不同的蓝移。根据前期试验结果进一步设计合成VR3的类似物VRW3(AC-C(VR)3DPG(RV)3CW-NH2),它是在VR3氨基酸序列羧基末端添加一个色氨酸。通过VRW3与脂质体膜的相互作用,进一步探讨VR3的抑菌机理。结果发现,VRW3和melittin分别产生了17和18的蓝移,但处于PC/cholesterol磷脂环境中VRW3及melittin分别产生4和16的蓝移,AvBD4衍生物RL38、GLI23和GLI13-5在PE/PG磷脂环境中分别产生了15、16和15的蓝移,而在PC/cholesterol磷脂环境中产生的蓝移数值分别是5、1和1。这些结果表明VR3及其类似物和三条AvBD4衍生物更偏爱与模拟细菌的细胞膜产生相互作用,这与上述抗菌肽的强抗菌活性和弱溶血活性的结果是一致的；通过荧光探针NPN和DiSC3-5的释放对外膜和内膜的通透性和完整性进行评价,发现检测的抗菌肽能破坏细菌的外膜完整性,并产生去极化；电镜试验结果表明,VR3、IR2、GLI23和GLI13-5可破坏菌膜,导致内容物泄露出来。凝胶阻滞试验显示,在低浓度时,AvBD4衍生物RL38与DNA相互结合,说明这该抗菌肽除了作用子细胞膜外,还可能进入胞内与核酸等物质相互作用。(7)根据酵母系统密码子的偏爱性,设计了抗菌肽GLI23的编码基因,并在两端引入限制性酶切位点,将合成后的基因片段连接到表达载体pGAPHaM中去,测序结果表明基因序列与设计的完全一致,从而成功构建了重组表达载体pGAPHaM-GLI23;将该表达载体通过电转化的方式转入到宿主毕赤巴斯德酵母GS115中去,并使用YPD培养基进行表达。抑菌效果表明,表达产物具有一定的抑菌活性,但表达产量比较低。本研究采用全新设计的思路成功设计出了一系列不同长度的β-发卡抗菌肽,筛选出含有16氨基酸残基的VR3具有最佳细胞选择性；通过不同结构的疏水性氨基酸作为发卡肽的片层氨基酸,获得含有脂肪族氨基酸的IR2具有最高的细胞选择性；此外,采用对天然抗菌肽进行改造的思路对AvBD4进行截取和氨基酸替换,筛选出具有较高的细胞选择性的GLI23和GLI13-5。我们对筛选出的抗菌肽进行结构与功能关系研究,初步探明了这些抗菌肽与膜之间的相互作用,并对抗菌肽进行了真核系统表达,在探索抗菌肽的研究方法及新型抗菌肽在临床及畜牧业中的应用提供借鉴和参考。