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近年来随着生活水平的提高,人们对畜产品的需求也越来越多,而对于畜牧业来讲,饲草饲料是基础,在我国北方,牧草质量高但气候干旱,从而导致牧草产量低,限制了北方畜牧业的发展,在我国南方,虽然水热条件好,牧草产量高但质量不高,总的来说,我国的饲草饲料是缺乏的,最终导致现在的畜牧业不能满足日前市场的需求。特别是在南方,优质豆科牧草极度缺乏成为限制南方畜牧业发展的一个大障碍。紫花苜蓿作为全世界公认的优质豆科牧草,如果能引进南方,它将对南方畜牧业的发展有很大的推动作用。但是在南方,土壤多为酸性土壤,尤其是酸性土壤中的铝毒对紫花苜蓿的生长极为不利,这大大限制了紫花苜蓿的南移,严重影响了紫花苜蓿产业在南方的发展。因此,培育对铝耐受力高的紫花苜蓿新品种是解决紫花苜蓿南移的关键。本试验以渝苜1号紫花苜蓿的15号株系为材料,利用农杆菌介导叶盘法,分别用组成型启动子柠檬酸合成酶基因和光诱导型柠檬酸合成酶基因对其进行遗传转化。并对15号株系和转基因植株进行PCR、RT-PCR和实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)检测,鉴定目的基因的整合与表达情况,然后进行叶片酶活性测定,叶片和根尖有机酸含量测定,根系柠檬酸分泌量测定及耐铝试验,并对不同启动子转基因植株进行了比较。本研究目前取得的主要研究结果如下:1通过遗传转化共得到33株抗性植株,其中组成型18株,光诱导型15株。经PCR鉴定获得6株转基因植株,分别为组成型CS-2、CS-3、CS-18、CS-66,光诱导型为rCS-4、rCS-9;再经RT-PCR鉴定有5株转基因植株能在RNA水平上转录表达,分别为组成型CS-2、CS-3、CS-18和光诱导型 rCS-4、rCS-9,其中rCS-4、rCS-9、CS-2、CS-3基因组中CS基因的相对表达量分别为野生株的10.69、107.39、701.03 和 1076.15 倍。2转基因植株的CS酶活性:转基因植株的CS酶活性均比WT高且达到极显著水平,其中组成型转基因植株CS-2的酶活性最高为0.09 NADH/min/mg protein,是野生株的1.26倍,其次是组成型CS-3,其酶活性为0.086 NADH/min/mg protein。组成型转基因植株CS-3、CS-18、CS-66的酶活性均比光诱导型转基因植株rCS-4的酶活性高且达到极显著,与光诱导型转基因植株rCS-9的酶活性差异均不显著。3转基因植株的叶片和根尖中的柠檬酸含量:转基因植株的叶片和根尖的柠檬酸含量均比野生株的要高;组成型转基因植株CS-3的叶片柠檬酸含量最高为86.74μmol/g fresh leaf,是野生株的1.56倍,其次是CS-2和rCS-9其叶片柠檬酸含量分别为78.24和78.12μmol/gfreshleaf;在转基因植株中,光诱导型rCS-4的叶片柠檬酸含量最低;组成型转基因植株CS-3的根尖柠檬酸含量最高为24.01μmol/g fresh root tips,是野生株的2.05倍,其次是CS-2其值为19.57μmol/g fresh root tips;不同启动子转基因植株根尖柠檬酸含量的差异达到显著,即组成型转基因植株的根尖柠檬酸含量明显高于于光诱导型的根尖柠檬酸含量。4转基因植株根系柠檬酸分泌量:在无铝条件下,各转基因植株与野生株的柠檬酸分泌量值均较低,野生株的柠檬酸分泌量值与大部分的转基因植株的值相当;当有20μM铝胁迫时,各植株的柠檬酸分泌量均明显增多,且各转基因植株的值均比野生株的高,其中组成型CS-2和CS-3的柠檬酸分泌量最多,分别为0.371μmol/l和0.368μmol/l是野生株的2.22和2.20倍。5转基因植株根伸长量和根尖染色:在没有铝胁迫时,各植株根生长正常,野生株的值与大部分转基因植株的根伸长量相当,根尖未见染色;当有20μM铝胁迫时,各植株的根生长均受到抑制,各转基因植株的根伸长量均比野生株的根伸长量要大,且它们与野生株的差异都达到了极显著,组成型CS-2的根伸长量最大,为野生株的2.98倍。各植株有不同程度的染色,其中野生株的染色面积最大,染色最深。本研究得到结论为:CS基因能整合到所有转基因植株的基因组中,并有效提高了转基因植株的CS酶活性,增加了转基因植株叶片和根尖的柠檬酸含量,因而在有铝胁迫时,转基因植株能分泌出更多的柠檬酸抵抗铝毒,表现出较强的耐铝能力。组成型启动子与光诱导型启动子相比,组成型启动子更有利于CS基因在紫花苜蓿基因组中表达。