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背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以对称性、小关节病变为主的慢性、进行性、破坏性自身免疫性疾病。在关节滑膜局部有CD4+T细胞浸润,并在特定遗传背景和局部炎症微环境下,CD4+T细胞功能呈现异常,是致使RA滑膜炎症的诱发和加重的中心环节。随着对CD4+T细胞其中的两种亚型Th17(T-helper 17 cells)与Treg(Regulatory T cells)细胞认识的不断深入,目前认为Treg细胞与Th17细胞失衡可能是导致RA发病的重要原因之一。目前,临床上治疗RA的药物主要有非甾体类抗炎药、改变病情抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂等。这些药物均有一定疗效,但由于具有较大毒副反应或高昂的花费,病人难以长期使用。羌活二黄汤(羌活独活秦艽薏苡仁忍冬藤黄芩姜黄莪术川芎甘草)为我科常用的治疗RA的中药复方,有较好的临床疗效,副作用小。其作用机制有待于深入研究。目的以AA(adjuvant arthritis,AA)大鼠为模型,研究不同剂量的羌活二黄汤的治疗效果,并从Treg/Th17细胞的角度探讨羌活二黄汤的治疗机制。方法一、羌活二黄汤对大鼠佐剂性关节炎的治疗效果1、佐剂性关节炎大鼠模型建立及评价(1)使用灭活结核杆菌与矿物油混合的佐剂于大鼠尾根部注射0.2m L(1mg/只),连续观察。(2)模型的评价系统:0分→正常;1分→1个趾关节红肿;2分→至少2个趾关节或整个足爪轻度红肿;3分→足爪红肿较重;4分→足爪重度红肿,缺乏弹性。总评分为每只大鼠足爪的评分的总和。总评分大于1分为模型建立成功。2、不同剂量的羌活二黄汤对大鼠佐剂性关节炎的治疗效果(1)将造模成功的30只大鼠随机分为5组,即:生理盐水对照组(模型组,2ml/100g体重)、甲氨喋呤组(每周0.4mg/kg)、羌活二黄汤高剂量组(18g/(kg·d))、羌活二黄汤中剂量组(9g/(kg·d))、羌活二黄汤低剂量组(4.5g/(kg·d))。另设正常对照组,为6只正常大鼠。各组大鼠常规给药,隔天观察记录每只大鼠关节炎指数评分、体重、足掌厚度、踝关节周径的变化。(2)以各组大鼠脾淋巴细胞为对象,使用cck-8试剂盒,检测各组大鼠脾淋巴细胞增殖情况。3、不同剂量的羌活二黄汤对佐剂性关节炎大鼠组踝关节的滑膜、血管的影响以各组大鼠踝关节为对象,苏木精-伊红常规染色,于显微镜下观察各组大鼠关节滑膜变化。二、从treg/th17角度探讨羌活二黄汤对佐剂性关节炎的治疗机制1、流式细胞技术检测大鼠脾cd4+cd25+cd127-treg细胞、cd4+il-17a+th17细胞的百分比。2、elisa方法检测血清il-6、il-17、tnf-α、tgf-β的含量。结果1.造模后大鼠第3天在注射部位可出现红斑,并逐渐出现溃疡,约第5天可见尾部结节,第8-10天可出现部分足趾的红肿,踝关节及整个足爪的肿胀可在第16天出现。以总的关节炎评分大于1分为造模成功。踝关节组织病理he染色示关节滑膜增生明显,甚至整个关节腔被关节滑膜填充,可见关节软骨破坏,大量新生血管翳。建模成功率为75%。2.与模型组比较,甲氨蝶呤组、中药高剂量组在给药后第24及28天时能够降低大鼠关节炎指数评分(p<0.01),减轻大鼠关节炎症。3.与模型组比较,甲氨蝶呤组、中药高剂量组在给药后第24及28天时大鼠体重增加较模型组快(p<0.05)。4.与模型组相比,甲氨蝶呤组、中药高剂量组在给药后第24天及28天时足掌厚度减少,足掌肿胀减轻,炎症缓解(p<0.05)。5.与模型组相比,甲氨蝶呤组在给药后第20、24及28天时大鼠足踝关节周径减少(p<0.05),中药高剂量组在给药后第28天时关节周径为((2.84±0.29)cm,p=0.006)。6.无论在pma刺激后24h、48h还是72h,甲氨喋呤及中药高剂量组较模型组均能明显抑制脾淋巴细胞的增殖(p<0.01)。7.与正常对照组比较,模型组脾淋巴Treg细胞百分比降低((5.75±0.46)%,P=0.000),而Th17百分比明显增高((1.84±0.45)%,P=0.004),呈失衡状态。经高剂量中药干预后,大鼠脾淋巴Treg细胞百分比显著上升((11.19±2.01)%,P=0.000),Th17百分比下降((0.98±0.35)%,P=0.041)。与模型组相比,中药中、低剂量组无明显治疗效果(P>0.05)。8.与正常对照组相比,模型组血清IL-6((134.21±16.58)pg/mL,P=0.000)、IL-17((36.26±5.62)pg/mL,P=0.001)、TNF-α((540.01±36.94)pg/mL,P=0.013)的含量明显增高,而TGF-β的含量降低((41.81±6.35)pg/mL,P=0.020)。与模型组相比,经甲氨蝶呤、高剂量中药干预后,血清IL-6、IL-17A及TNF-α含量明显降低,而TGF-β的含量明显增高。结论羌活二黄汤对大鼠佐剂性关节炎具有一定的治疗效果,且有一定的剂量关系,可降低血清IL-6、IL-17及TNF-α的水平,上调TGF-β的含量,其机制可能与纠正脾CD4+T淋巴细胞亚群Treg/Th17失衡相关。