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水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis)是由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的一种急性传染病。自然条件下主要特性为剧烈腹泻,幼龄水貂具有较高的发病率和死亡率。随着世界毛皮动物饲养业的快速发展,水貂病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖业三大疫病之一,给全世界养貂业带来巨大的经济损失。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay,GICA)是免疫层析技术、胶体金标记技术及免疫反应的结合体。胶体金是一种常用的标记技术,以胶体金作为标志物应用抗原、抗体检测的一种新型的检测方法,具有简单快速、结果清晰,可通过肉眼观察、灵敏度高、无污染和携带方便等优点。因此该技术得到了迅速发展,在兽医学领域应用也越来越多。本研究采用竞争法建立检测MEV胶体金试纸条,柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金颗粒与抗MEV单克隆抗体合成金标探针。纯化的MEV VP2蛋白包被在NC膜上作为检测线(T线),羊抗鼠IgG包被在NC膜上作为质控线(C线),组装成胶体金层析试纸条。根据水貂肠炎病毒MEVB毒株,设计特异性引物扩增MEV VP2结构蛋白基因获得1 773 bp基因片段;将该基因片段连接到克隆载体上,验证正确后定向连接到原核表达载体PET-30a,构建MEV VP2基因原核表达重组质粒PET-30a-VP2。将该重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3),重组质粒经酶切和测序鉴定正确后进行诱导表达。IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果发现该蛋白在37?C,诱导剂IPTG终浓度为1.0 mmol/L条件下良好表达,鉴定该重组MEV VP2蛋白以包涵体的形式存在,大小约为70 KD,用镍柱纯化后获得较纯的融合蛋白。采用蔗糖密度梯度超速离心法纯化MEVB细胞培养物。经纯化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠,制备脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法的筛选,获得6株能稳定分泌抗MEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4、6、8、10、13、14。该6株单克隆抗体分别进行了腹水效价测定,结果为单抗4和13抗体效价为1.28×105,单抗6和14抗体效价为2.56×105,单抗8和10抗体效价为5.12×105;特异性试验鉴定该6株单克隆抗体能与犬细小病毒(CPV)及水貂肠炎病毒(MEV)呈阳性反应,但不与犬瘟热病毒(CDV)、水貂阿留申病毒(AMDV)及犬腺病毒(CAV)发生反应;经亚型鉴定,其中单抗4、10为IgG2b亚型、单抗6为IgG1亚型,单抗8、13、14为IgG2a亚型;间接免疫荧光鉴定该6株单克隆抗体均能使接毒的F81细胞产生绿色荧光;免疫印迹试验结果显示该6株单克隆抗体可在约70 KD处出现特异性反应条带。本试验为MEV的深入研究、快速诊断方法的建立奠定了基础。采用柠檬酸三钠还原法制备出20 nm胶体金颗粒,与抗MEV单克隆抗体10偶联形成金标探针。优化最佳试纸条各项参数,将MEV VP2蛋白以0.8 mg/mL的浓度包被于NC膜上作为检测线(T线),将羊抗鼠IgG以1 mg/mL浓度包被于NC膜上作为质控线(C线)。该胶体金检测试纸条的敏感性为1:64。该试纸条检测MEV和CPV样品为阳性结果,而对CDV、CAV和AMDV等相关病毒样品检测均为阴性结果,说明该试纸条特异性良好。与CPV胶体金试纸条方法符合率可达到94.1%。在4?C和25?C条件下可以保存6个月其敏感性和特异性没有明显的变化。本研究成功的建立检测MEV胶体金试纸条,为早期诊断、预防和控制MEV具有重要的现实意义。