研究背景：　　肺癌是目前全球致死率第一的恶性肿瘤，其发病率逐年攀升。对肺腺癌驱动基因的深入认识发现携带EGFR、ALK等基因异常的肿瘤患者可以从针对上述基因的靶向治疗中获益，然而大部分患者在治疗后逐步出现耐药。近年来免疫治疗的成功引起了极大的关注。临床研究证实靶向免疫检查点抑制剂（ICIs）可在一线和二线治疗中均显著改善非小细胞肺癌的预后。然而TKI治疗进展后的EGFR突变的患者PD-1 /PD-L1阻断治疗反应率低，导致众多ICIs一线治疗的试验将EGFR突变作为排除标准。然而BIRCH研究显示，使用atezolizumab作为一线治疗时，EGFR突变肺癌患者的有效率不劣于野生型。为探究EGFR突变患者能否从ICIs的一线治疗中获益，需要系统比较ICIs的疗效预测分子。鉴于ICIs的疗效主要依赖于肿瘤微环境（TME）的免疫表型，而EGFR TKI治疗可改变肺癌肿瘤的微环境。因此对未经治疗条件下，不同EGFR状态患者之间免疫微环境的系统性对比研究具有重要临床意义。　　表皮生长因子受体（EGFR）突变是亚洲地区最常见的基因改变，其中19号外显子缺失和21号外显子L858R点突变是发生率最高的2个亚型，既往的研究认为两组亚型具有相同的生物学效应。来源于一代和二代的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗临床数据表明19del和L858R虽都为敏感型突变，但他们对于TKI的反应具不尽相同：在一代EGFR TKI的小样本研究和LUX-Lung 3与LUX-Lung 6结果的分析中发现，19del亚型治疗效果优于L858R亚型。目前的研究表明，除肿瘤细胞自身的因素外，肿瘤免疫微环境也影响EGFR TKI的敏感性。如肿瘤相关巨噬细胞浸润与非小细胞肺癌患者对EGFR TKI的敏感性有关且不依赖于EGFR突变的状态。然而两种突变对肿瘤微环境是否产生差异性的影响尚不清楚。免疫微环境也决定了免疫检查点抑制剂治疗的效果，因此不同EGFR突变亚型是否可能对ICIs的治疗同样具有差异性也有待探索。　　衰老是肿瘤的最大危险因素，然而美国西南肿瘤学会的回顾性研究显示老年患者参与临床研究的比例显著低于非老年患者。免疫治疗的临床前研究也是在更为年轻的患者中进行的，导致老年患者的代表性不足。然而在前期的有限的临床数据中显示，老年患者对ICIs的敏感性低于或相似于非老年患者，同时超进展现象在老年患者中的发生率显著升高，其机制尚不清楚。针对老年患者免疫系统的研究指出：老年患者外周血中参与髓系来源抑制性细胞（MDSCs）的分化促炎细胞因子增加，老年人的免疫细胞分泌一系列促炎细胞因子，诱导低强度的慢性炎症，导致外周血中具有免疫抑制功能的MDSCs比例的提高。MDSC又促Treg分化、分泌IL-10和精氨酸酶、表达共抑制分子等影响细胞毒性T细胞的功能。同时随着年龄的增长，终末分化或记忆T细胞的比例增加，效应性T细胞减少，细胞毒性CD8+T细胞和Th1 CD4+T细胞分化缺陷，T细胞增殖和杀伤活性降低。虽然衰老对免疫系统的影响研究较多，但以动物模型、非肿瘤患者免疫器官、肿瘤患者外周血的分析为主。而老年患者肿瘤中真实的免疫微环境却鲜有研究，因此对老年患者免疫微环境的深入研究具有重要意义，通过这些分析可能对老年患者新的治疗策略提供新的依据。　　为了明确肺腺癌患者EGFR状态对免疫微环境的影响，并观察EGFR状态与免疫检查点抑制剂疗效相关分子的关系，我们通过免疫组化的方法对比了EGFR突变型和野生型初治肺腺癌手术标本中免疫细胞浸润和免疫分子的表达。为深入探讨EGFR突变亚型的免疫微环境的差异，我们对19del和L858R突变初治的肺腺癌肿瘤标本的免疫微环境进行了系统的对比研究。为明确老年患者免疫微环境的特征，我们采用TCGA数据库获得的501例肺腺癌患者作为发现组和105例肺腺癌患者手术组织标本作为验证组，对比老年与非老年患者免疫微环境的差别。　　研究方法：　　1. EGFR状态对免疫微环境的影响　　ARMS法检测105例初治肺腺癌患者手术标本的EGFR状态。通过免疫组织化学的方法系统分析了EGFR突变型和野生型肿瘤癌巢和间质中免疫细胞：CD4+T、CD8+T、调节性T细胞、记忆细胞、髓系来源抑制性细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）；肿瘤间质的主要成分肿瘤相关成纤维细胞（CAF）以及免疫检测点治疗的重要疗效预测生物学标志PD-L1的表达。通过卡方检验分析 TAM 高浸润肿瘤的临床特征。生存分析比较EGFR突变和野生型无疾病进展时间的差异。分析TCGA数据库来源501例肺腺癌患者RNA-seq数据中MMP9和VEGFA的表达。　　2.EGFR 19del和21 L858R突变亚型免疫微环境的对比　　通过免疫组织化学的方法系统分析了19del和L858R突变亚型肿瘤癌巢和间质中免疫细胞：CD4+ T、CD8+ T、调节性T细胞、记忆细胞、髓系来源抑制性细胞和肿瘤相关巨噬细胞；肿瘤间质的主要成分肿瘤相关成纤维细胞以及免疫检测点治疗的重要疗效预测生物学标志PD-L1的表达。生存分析比较两种突变无疾病进展时间的差异。　　3. 老年与非老年肺腺癌初治患者免疫微环境的对比　　本研究共由两部分患者及其临床信息组成：发现组为TCGA数据库获得的501例肺腺癌患者（RNA-Seq表达谱及临床信息）和TCIA数据库574例肺腺癌患者（突变数量、新抗原数量、新抗原亚克隆比例、HLA 分子表达和临床信息）；验证组包括 2010 年 1月至2013年12月期间在重庆新桥医院接受根治性肿瘤切除的105例肺腺癌患者，获取其手术组织标本和临床信息。R语言Bioconductor 的 gsva 包计算 28 种免疫细胞的ssGSEA评分，并比较不同年龄组28种免疫细胞浸润的差别。据TCGA数据库中标准化 RNA-Seq 结果分析不同年龄组中免疫细胞效应分子和免疫抑制分子的表达。获取TCIA数据库574例肺腺癌患者突变数量、新抗原数量、新抗原亚克隆比例、HLA分子表达，并用相关性分析和秩和检验观察其与年龄的关系。　　研究结果：　　1. EGFR突变下调肿瘤癌巢中肿瘤相关巨噬细胞浸润　　我们通过免疫组化的方法对比表皮生长因子受体突变与野生型患者免疫微环境的差异。在本项研究中我们发现，与野生型相比，EGFR突变型肺腺癌患者肿瘤癌巢CD68阳性细胞浸润显著减少，但CD4 + T、CD8 +T、调节性T细胞和髓系来源抑制细胞的浸润未观察到统计学差异。肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞PD-L1的表达，以及在间质中肿瘤相关成纤维细胞的浸润水平在EGFR突变和野生型中无显著差异。由于肿瘤相关巨噬细胞通过释放促血管生长因子和基质金属蛋白酶促进肿瘤迁移和侵袭。我们发现TAM高浸润患者淋巴结转移风险更高。EGFR突变患者MMP9和VEGFA表达显著降低。EGFR突变患者的无疾病生存时间显著延长，mDFS比野生型延长了19个月。　　2.EGFR 19del突变亚型较L858R肿瘤间质CD8+T浸润减少　　通过免疫组化的方法观察并对比表皮生长因子受体19del和L858R突变亚型肺腺癌手术标本免疫微环境的差异。我们发现，与L858R亚型相比，19del亚型在肿瘤间质中CD8 阳性 T细胞密度更低，Treg密度有降低的趋势；在肿瘤癌巢中，CD68 阳性细胞密度有降低趋势。两种亚型的无疾病进展时间无统计学差异。　　3. 老年患者肿瘤突变负荷低肿瘤组织中免疫细胞富集CTL细胞功能减退　　在发现队列中，TCIA 来源的数据则发现年龄与肿瘤组织的突变负荷呈负相关，随年龄增长新抗原减少，与ICIs耐药相关的新抗原亚克隆比例逐步升高，HLA-I、II类分子表达与年龄正相关。TCGA 数据库来源的 28 种细胞分析提示随年龄增长肿瘤组织中21 种免疫细胞浸润增加，T 细胞趋化因子水平逐步升高，同时 CTL 功能性效应分子GZMB、PRF1、GNLY、GZMA、GZMM等表达随年龄增加而下调，T细胞功能抑制相关的分子 HAVCR2、CTLA4、TIGIT、TNFRSF18、KLRG1、HHLA2 表达与年龄呈正相关，PD-L1表达在60岁以上组有增高的趋势，具有免疫抑制功能的Treg、MDSC和TAM升高。验证队列中发现老年患者肿瘤癌巢和间质中CD8+ T细胞和调节性T细胞数量显著升高，肿瘤浸润免疫细胞上PD-L1表达和肿瘤相关成纤维细胞较非老年患者有下降趋势。　　研究结论：　　1. 肺腺癌中 EGFR 突变参与调控肿瘤免疫微环境，EGFR 突变患者肿瘤癌巢中肿瘤相关巨噬细胞降低伴随其功能的减低，使EGFR突变患者生存获益。　　2. EGFR 突变亚型间免疫微环境存在差异， 19del 突变亚型较 L858R 肿瘤间质CD8+T浸润减少，肿瘤相关巨噬细胞也有减少的趋势。　　3. 老年肺腺癌患者具有免疫抑制的微环境且具有免疫治疗原发性耐药的多项特征：肿瘤突变负荷低、新抗原的亚克隆比例高、高水平的 MDSC 和 Treg、免疫抑制分子高表达、CD8+T细胞功能减退、肿瘤浸润免疫细胞中PD-L1表达水平降低。