研究背景：放免治疗(Radioimmunotherapy, RIT)是目前最有发展前景的肿瘤治疗方法之一,尤其适用于血液系统的恶性肿瘤,其基本原理是将针对肿瘤相关抗原的放射性标记单抗注射到肿瘤患者体内,利用抗体作为放射性核素的载体将p射线导向至肿瘤部位,以达到选择性破坏肿瘤的目的。然而,由于靶与非靶比值并非理想以及选择性转运至肿瘤内的辐射剂量较低,RIT并未达到满意的临床预期效果,使得其普遍应用受到限制。而预定位放免治疗(Pretargeted radioimmunotherapy, PRIT)方法的应用则可以克服上述不足,它采用分开给药方法,先将抗肿瘤抗体靶向定位于肿瘤,随后注入显像或治疗放射性核素,使核素与已定位在肿瘤上的抗体结合,而未与抗体结合的核素则迅速从体内排泄。越来越多的动物实验及临床研究证实：与直接标记单抗的放免显像与放免治疗(RIT)相比较,PRIT是安全,可行的,且改善了肿瘤显像与治疗的效果,能提高直接传递至恶性肿瘤细胞上的放射性剂量,同时减轻正常组织细胞的非特异性辐射毒性作用。用于临床肿瘤RIT治疗的放射性核素应具备适当的射程和一定能量的p射线,而18是近年出现的一种较理想的核素,p射线能量较高,对肿瘤细胞有较强的杀伤力,而丫射线又适于显像,便于临床上估算吸收剂量和进行药代动力学研究,可以同时进行显像与治疗。188Re具有良好的核物理与生物学行为,文献研究表明,其高铼酸盐在各脏器吸收较少并很快地通过尿排泄,在人体内的生物半衰期小于10h,不会对人体造成严重的辐射损伤,有可能在肿瘤的治疗方面起到很好的作用。本研究课题以CD45单抗作为特异性靶向淋巴瘤的转运载体,根据预定位技术的原理,以生物素化CD45单抗先预定位于肿瘤,24h后注入188Re标记亲和素,利用亲和素与生物素间的高亲和力以及标记亲和素体内快速清除,达到降低本底,增大靶／非靶比值。探索和建立188Re对亲和素及CD45单抗的标记方法,以直接标记单抗作为对照,在淋巴瘤荷瘤小模型上实现预定位放免显像的实验研究,观察相应的生物学分布,为进一步开展淋巴瘤预定位放免治疗研究提供实验基础。目的：1、探索188Re直接法标记CD45单抗的方法学,并观察其在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内的生物学分布特性。2、评价CD45单抗介导的188Re-亲和素二步法预定位在Raji细胞移植瘤小鼠模型中的放免显像效果。3、观察CD45单抗介导的188Re-亲和素二步法预定位对体外培养的Raji细胞的抗肿瘤抑制作用。方法：1188Re直接法标记CD45单抗及其在正常小鼠体内生物分布研究1.1188Re标记CD45单抗188Re对CD45单抗的标记采用直接标记方法,以2-巯基乙醇作为蛋白的还原剂,氯化亚锡作为188Re的还原剂,以葡庚糖酸钠作为中间弱配体。将188Re直接标记在单抗上,利用纸层析法测定标记物的标记率与放化纯度。1.2188Re-CD45单抗的体外稳定性实验取经PD10过滤纯化后的188Re-CD45单抗溶液100μL,分别加入到1mL的鼠血清和生理盐水中,置于37℃水浴箱中孵育1h、2h、4h、8h、12h和24h,分别于不同时间点取少量样品纸层析法测定其放化纯度,以测定其体外稳定性。1.3188Re-CD45单抗在正常小鼠体内的生物分布研究取昆明种小白鼠9只,于小鼠尾静脉注射188Re标记物后3h、6h和24h各取3只小鼠,处死后分别取血液及主要脏器,称重并测定放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器每克组织百分注射剂量率(%ID/g),观察标记物在正常小鼠体内的生物学分布特性。2人Raji细胞移植瘤小鼠模型的二步法预定位法放免显像研究2.1Raji细胞株Raji细胞株由南方医科大学南方医院血液科提供。用RPMI-1640加入10%胎牛血清培养液培养,在37℃和5%CO2和95%相对湿度的孵箱内孵育。2.2建立淋巴瘤实验动物模型1)Nod-Scid小鼠(非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠)4-6周龄(雌性),体重为19-21g,为T’ B’NK细胞缺陷的严重联合免疫缺陷动物模型。饲养于南方医科大学动物中心SPF实验室。2)收集处于对数期生长的的Raji淋巴瘤细胞并离心,不含血清RPMI-1640培养基制成细胞悬浮液(>1×108/mL),0.2mL/只,接种于4-6周龄雌性Nod-Scid小鼠右侧腋窝处皮下,于无特定病原体(SPF级)环境下饲养。记录肿瘤成瘤时间,成瘤后每2天用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b。2.3生物素化CD45单抗的制备1)取0.25mg CD45单抗,按CD45单抗：生物素酯(摩尔比)=1：20取样,在0.1M pH8.5碳酸氢钠溶液中反应,于室温下振荡反应1h,将反应液注入PD-10层析柱内,放入离心机中(2000转/minx2次)离心层析。2)采用HABA/Avidin试剂进行CD45单抗生物素化程度测定取0.1mL生物素化CD45单抗,加入0.9mL HABA/Avidin试剂中,室温振荡反应1mmin,当反应溶液由橙红色转变成淡黄色时,测量其500nm时的OD值。按照HABA/Avidin试剂说明书计算抗体的生物素化程度。2.4生物素化CD45单抗的免疫活性及生物素结合活性的测定采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定生物素化CD45单抗的免疫活性及生物素化CD45单抗的生物素结合活性。2.5188Re标记亲和素及188Re标记CD45单抗参见1.1的标记部分。2.6淋巴瘤荷瘤小鼠二步法预定位体内生物分布研究取Raji细胞移植瘤小鼠6只,随机分为2组,每组3只。实验组为预定位组,对照组为188Re-CD45单抗组。预定位组小鼠先经尾静脉注射生物素化CD45单抗50μg/200μL,24h后经腹腔注入188Re-亲和素7.4MBq(50μg/200μL);对照组为188Re标记CD45单抗组,静脉注射188Re-CD45单抗100μg/100μL,于注药后24h断颈处死裸鼠后,取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼、血液及肿瘤,称重后在γ计数仪中测量放射性计数,经放射性衰变校正后计算各脏器的%ID/g及肿瘤／非肿瘤(T/NT)比值。2.7淋巴瘤荷瘤小鼠的二步法预定位放免显像研究取淋巴瘤荷瘤小鼠6只,随机分为2组,每组3只。实验组为预定位放免显像组,对照组为188Re-CD45单抗放免显像组,具体给药时间及方法同上述生物分布实验；注药后分别于30min、1h、2h、6h和23h进行前后位及后前位静态显像。利用感兴趣区(ROI)技术,以肿瘤组织作为T,肌肉组织作为NT,计算不同显像时间点的T/NT比值。3二步法预定位对Raji细胞的体外抗肿瘤作用的实验研究3.1188Re-CD45单抗及188Re-亲和素的制备参见1.1及2.5的标记部分。3.2188Re-CD45单抗与Raji细胞的体外竞争结合实验将处于对数期生长的Raji细胞浓度分别调整为6×104、3×105、6×105、3×106和6×106,每个浓度加3管,各管再加入188Re-CD45单抗标记物。在37℃细胞培养箱中温育1h,分别测各管总放射性计数(T)；4℃离心(2000r/min,5min)后去上清液,用PBS溶液洗涤2次,再测量结合在细胞上的放射性计数(B)并计算其结合率。同时做竞争结合实验,在各管细胞中先加入50μg未标记的CD45单抗,然后加入20μL的标记物,余步骤同上。3.3188Re标记物不同处理组对体外Raji细胞增殖的抑制实验采用CCK-8法测定对体外培养的肿瘤细胞的抑制效应。将Raji细胞浓度调整为4×104/孔,接种于96孔板,共分4个实验组：二步法预定位组(生物素化CD45单抗+188Re-亲和素)、188Re-CD45单抗组、188Re-亲和素组和188ReO4-组,对照组采用0.1M磷酸盐缓冲液；并设空白调零组(只加药和培养液,没有细胞),分别于1h、2h、4h、8h、10h和12h后取出,加入10μL CCK-8继续孵育1-2h,于不同时间点取96孔板,用酶标仪检测450nm波长吸光度。计算Raji细胞存活率和抑制率。4统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示,CCK-8数据按析因设计资料的方差分析进行计算,其余计量资料如为两组间比较,则运用两独立样本t检验计算；如为三组间比较,运用One-WayANOVA计算,上述结果以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：1188Re直接法标记CD45单抗及其在正常小鼠体内生物分布研究1.1188Re-CD45单抗的标记率及放化纯度测定用纸层析法测定188Re标记CD45单抗的标记率86%,经PD-10层析柱分离纯化后188Re-CD45单抗的放化纯度>90%。1.2188Re-CD45单抗的体外稳定性测定188Re标记物在室温下放置24h的放化纯度为74%,与鼠血清或生理盐水混匀后,并置于37℃水浴箱中孵育24h后其放化纯度仍有64%和63%。1.3188Re标记CD45单抗在小鼠体内的生物分布研究188Re-CD45单抗在小鼠体内生物分布测定结果示：肾脏的放射性明显高于其他脏器,且清除时间长,肾脏的%ID/g在3h和24h分别为14.46±2.77和7.46±2.07,其次是肝脏,而其他脏器放射性分布随时间延长迅速降低。2Raji细胞移植瘤小鼠模型的二步法预定位放免显像研究2.1生物素化CD45单抗的生物素化程度及188Re-亲和素的结合活性的测定经测定平均每个CD45单抗结合40个生物素分子。ELISA法测定生物素化CD45单抗的免疫活性平均为(90.57±8.13)%。生物素-琼脂糖凝胶法测定188Re-亲和素的生物素结合活性平均为(72.37%±15.32)%。2.2淋巴瘤荷瘤小鼠二步法预定位体内生物分布研究二步法预定位组荷瘤小鼠的体内生物分布测定结果表明：注射标记物后24h肿瘤的%ID/g为(1.34±0.52)%,肾脏和肝脏的%ID/g分别为(6.77±2.32)%和(2.81±1.25)%,其他脏器内的%ID/g保持在较低水平；24h后肿瘤仍有较高的摄取；而肿瘤／血液比值最高为4.86,肿瘤／肌肉比值为8.00±0.88。而188Re-CD45单抗组荷瘤小鼠的体内生物分布结果表明：肝脏、脾脏及肾脏内见明显放射性聚集,血池内见较多放射性分布,肿瘤部位见有少量放射性集聚,肿瘤／血液比值最高仅为0.63,肿瘤／肌肉比值为3.21±0.24。2.3淋巴瘤荷瘤小鼠的二步法预定位放免显像研究二步法预定位组荷瘤小鼠于注药后30min、1h、6h和23h的SPECT显像结果示：整个显像期间血池内放射性均较低,肝脏和脾脏内见较多放射性浓聚；注射后1h,移植肿瘤见显影,随着时间的延长瘤内放射性分布增多,1～6h肿瘤显影清晰,并持续到23h。采用ROI技术计算肿瘤／肌肉比值于注药后30min、1h和6h分别为1.73、2.15和2.53。而188Re-CD45单抗组荷瘤小鼠注药后的SPECT显像示：于肝脏、脾脏和肾脏内见明显放射性聚集,肿瘤部位显影模糊：20h血池内仍见有较多放射性分布,肿瘤部位见有少量放射性集聚。ROI技术测得肿瘤／血液比值为0.98。3二步法预定位对Raji细胞的体外抗肿瘤作用的实验研究3.1188Re-CD45单抗与Raji细胞的体外竞争结合实验经多次测定188Re-CD45单抗与Raji细胞的特异性结合率为(70.92±1.91)%。而在竞争结合实验中,同时加入188Re-CD45单抗和过量的CD45单抗,细胞结合率平均仅为(7.96±0.87)%。3.2188Re标记物不同处理组对体外Raji细胞增殖的抑制作用CCK-8法测定Raji细胞增殖抑制实验结果示：二步法预定位组、188Re-CD45单抗组、188Re-亲和素组和188Re04-组对Raji细胞的增殖均有抑制作用,其抑制率与剂量呈正相关关系；在放射性剂量相同的情况下,二步法预定位组在各时间点抑制作用均强于188Re-CD45单抗组、188Re-亲和素组和188Re04-组,二步法预定位组与其他各组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；而188Re-亲和素组和188Re04-组的抑制作用并无显著差异(P>0.05)。结论:1建立了188Re直接法标记CD45单抗的方法学,该方法简便易行,标记率及放化纯度均较高,188Re-CD45单抗在体内外具有良好的稳定性。2188Re-CD45单抗在荷瘤小鼠体内的血清除较缓慢,肝脾和肾脏内见明显放射性聚集,肿瘤部位见有少量放射性集聚。而二步法预定位的引入则观察到荷瘤小鼠体内的血清除加快,主要经肾脏排泄,其他组织的放射性随时间延长迅速减低,肿瘤组织中放射性摄取增多,且在肿瘤组织内停留较长时间。3CD45单抗介导的188Re-亲和素二步法预定位在淋巴瘤荷瘤小鼠体内具有较好的特异性和靶向性；与188Re直接标记CD45单抗相比较,二步法显著改善肿瘤的T/NT比值,使得肿瘤显影更为清晰。4体外细胞增殖抑制试验结果提示二步法预定位对Raji细胞具有明显的抑制作用,为下一步开展淋巴瘤荷瘤小鼠二步法预定位放免治疗提供实验依据。