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目的机体内肺癌细胞分泌的外泌体与肺癌的发生发展密切相关,外泌体及其内容物正逐渐发展为肺癌的生物标志物。该研究拟通过肺癌患者血浆外泌体水平的检测及其micro RNAs（mi RNAs）生物标志物的筛选,以期从外泌体数目和携带信息两方面为肺癌早期筛查及诊断提供新的筛查技术与实验依据。方法1.两种方法提取细胞上清外泌体的比较培养人肺腺癌细胞株A549细胞,分别采用超滤联合共沉淀法与超速差速离心法提取细胞培养上清外泌体。使用透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小;Western Blot实验鉴定标志蛋白CD63、TSG101和HSP70蛋白表达;纳米颗粒跟踪分析技术鉴定外泌体粒径分布。2.构建外泌体的比率型荧光定量检测方法首先,将Cy5荧光基团标记的生物素化发夹型CD63核酸适配体（cy5-Apt）固定到链霉亲和素磁珠上。其次,将SYBR Green I双链特异性核酸染料混合嵌入发夹型核酸适配体的双链部分中,构建比率型荧光免疫磁珠。当外泌体存在时,核酸适配体捕获外泌体导致适配体结构改变,Cy5荧光基团的荧光恒定,而SYBR Green I染料被竞争脱落,SYBR Green I染料的发射光强度大幅减弱,根据两种荧光物质被激发的荧光信号比值变化对溶液中的外泌体进行定量检测。对磁珠、Cy5-Apt、SYBR Green I在反应体系中的用量以及免疫磁珠捕获外泌体时的反应时间与反应温度进行单因素法优化,建立比率型荧光免疫磁珠检测外泌体的方法并进行方法学评价。取16份肺癌患者血浆和10份健康对照者血浆,PBS稀释100倍后用该方法对血浆外泌体浓度进行检测,比较肺癌患者与健康对照者的血浆外泌体水平。3.肺癌患者血浆外泌体差异表达mi RNA的分析选取6例肺癌患者和4例健康对照者血浆样本,采用超速差速离心法提取血浆外泌体,对提取的血浆外泌体使用透射电镜和纳米流式细胞仪对其结构和粒径分布进行鉴定。抽提血浆外泌体RNA,并采用Agilent Bioanalyzer对抽提的RNA质检后,经过反转录、PCR扩增、长短筛选后构建血浆外泌体的mi RNA文库。根据已知的成熟体mi RNA以及新预测的mi RNA的序列,采用高通量测序技术进行表达量统计。通过Target Scan、PITA、mi RNAorg三个数据库进行靶基因预测,采用R软件进行靶基因的KEGG和GO分析。结果1.两种方法提取细胞上清外泌体的比较透射电镜显示两种方法提取的外泌体均可观察到典型的杯盘状结构,粒径分布结果相似,且均表达三种标志蛋白CD63、TSG101和HSP70。2.构建外泌体的比率型荧光定量检测方法（1）比率型荧光免疫磁珠的表征对修饰有比率型荧光探针的磁珠检测Zeta电位与水合粒径,发现链霉亲和素磁珠平均粒径为326.5 nm,Zeta电位为-3.11 m V,在修饰Cy5-Apt后,水合粒径增大到418.8 nm,Zeta电位降低为-29.7 m V,在加入SYBR Green I核酸染料构成比率型荧光免疫磁珠后,水合粒径增大到514.2 nm,Zeta电位改变为-25.8m V。（2）条件优化单因素条件优化后,磁珠的最优反应用量为60μg,Cy5-Apt最优反应浓度为400 nmol/L,SYBR Green I最优浓度为30×,外泌体孵育温度和时间分别选用25℃和30 min。（3）标准曲线和方法学评价在8.0×10~4～1.0×10~7个/μl范围内,标准曲线为y=3.49·lg（x/10~4）-0.63(y:Δ(FCy5/FSYBR Green I),x:CExosome),R~2=0.996,检出限为4.0×10~4个/μl,相对标准偏差为0.6%～26.4%,低、中、高三个浓度的加标回收率分别为94.5%、95.4%、97.2%,特异性结果显示该方法检测白蛋白、脂质体、微囊泡、A549细胞碎片的信号值远低于外泌体。（4）血浆样品分析健康对照组血浆外泌体浓度范围为1.78×10~5～3.57×10~6个/μl,肺癌组血浆外泌体浓度在9.43×10~5～9.38×10~6个/μl范围之间。采用Mann-Whitney U非参数检验比较两组的血浆外泌体浓度水平,差异有统计学意义（P<0.01）。3.肺癌患者血浆外泌体差异表达mi RNA的分析纳米流式细胞仪与透射电镜对提取的血浆外泌体鉴定显示,提取的肺癌患者与健康对照者的血浆外泌体大小与形态均符合外泌体标准。外泌体mi RNA经过提取、质检、测序、筛选过滤后进行差异mi RNA表达分析,以P值<0.05,且|log2Flod Change|≥1作为差异筛选标准,两组间有142个mi RNAs的表达水平呈现显著差异,其中,在肺癌患者中62个mi RNAs表达上调,80个mi RNAs表达下调。对这些差异mi RNAs的靶基因进行GO和KEGG富集分析,GO分析显示这些靶基因主要参与了以DNA为模板的转录、以DNA为模板的转录调控、信号转导、金属离子结合、ATP结合、DNA结合等多种生物学过程和分子功能;并存在于细胞核、胞浆、细胞质、细胞膜、外泌体和线粒体等多种细胞成分中。KEGG分析显示这些靶基因主要参与轴突导向信号通路、钙信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、粘着斑激酶、癌症蛋白聚糖、c AMP信号通路、人类乳头瘤病毒感染、Rap1信号通路、小细胞肺癌等内分泌和肿瘤相关信号通路。结论1.构建的外泌体比率型荧光定量检测方法,检出限为4.0×10~4个/μl,具有快速、灵敏、准确度高、特异性强等优点,可用于血浆样品的定量检测。2.肺癌患者与健康对照者血浆外泌体的mi RNAs高通量测序筛选出62个mi RNAs在肺癌表达上调,80个mi RNAs表达下调,可作为肺癌候选的生物标志物。