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一、研究背景原发性肝癌(HCC)是我国最常见恶性肿瘤之一,死亡排位为第3位。年死亡人数约12万,占全世界肝癌死亡人数的40%。传统中药对提高肝癌患者生存质量,改善机体的一般状况以及延长生存期有一定帮助,但对肝癌本身杀伤作用有限。有毒中药单体的抗肿瘤研究是近年来肿瘤研究领域的热点之一,积极探索中药单体成分对肝癌的抗肿瘤作用,对开发新的肝癌治疗药物具有深远意义。蟾毒灵(Bufalin)是中药蟾酥中提取的一种毒性配基之一,属于细胞拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂,为蟾毒配基中抗肿瘤作用最强者。蟾毒灵在血液肿瘤、前列腺癌、胃癌等抗肿瘤方面的研究已有报道,机理方面的研究已涉及到肿瘤细胞分化、凋亡的诱导及相关基因的表达,信号转导以及逆转多药耐药等方面,但均限于体外研究,有关蟾毒灵体外诱导人肝癌细胞凋亡的机理研究及体内的抗肿瘤作用的研究尚未见报道。为此,我们在既往对蟾毒灵抗肿瘤研究基础上,建立裸小鼠人肝癌(BEL-7402)/小鼠肝癌(H22)原位移植模型来研究其体内的抗肿瘤作用,并对原位诱导细胞凋亡的机理作初步探讨。体外对蟾毒灵诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡的相关基因bcl-2/bcl-2 mRNA、bax/bax mRNA的表达以及凋亡信号传导通路NF-κB/ p38MAPK的影响作进一步的研究,为临床应用蟾毒灵治疗肝癌提供实验依据。 二、研究目的1.探讨Bufalin对裸鼠人肝癌(BEL-7402)/小鼠肝癌(H22)原位移植模型的抗肿瘤作用及其原位诱导凋亡的相关机理。2.体外观察Bufalin对人肝癌细胞BEL-7402生长抑制及诱导凋亡作用,并从凋亡相关基因bcl-2/bcl-2 mRNA、bax/bax mRNA表达以及凋亡信号传导通路NF-κB/ p38MAPK对其诱导肝癌细胞凋亡机理作进一步的探讨。3.为临床应用Bufalin治疗中晚期肝癌提供科学的实验依据。 <WP=8>三、研究内容第一部分 Bufalin对裸鼠人肝癌/小鼠肝癌原位移植模型抗肿瘤作用的在体研究1.蟾毒灵抗肿瘤剂量的初步界定:ICR小鼠18只,平均分为3组,每组6只。Bu分别按2mg/kg, 1.5mg/kg和1mg/kg三个剂量,腹腔注射,每日1次,d1-10,观察动物体重、食欲、行为等变化,初步界定蟾毒灵抗肿瘤大、中、小剂量。2.采用肝内隧道植入法,建立裸鼠人肝癌/小鼠肝癌原位移植模型各75只,随机分为大、中、小剂量组(Bu1-3)、阳性对照组(ADM组)和阴性对照组(NS组),每组各15只。两组均于造模后第12d剖腹探察,测量肿瘤大小。于第13d开始给药,Bu1-3分别按1.5mg/kg, 1.0mg/kg和0.5mg/kg,腹腔注射,每日1次,d1-10。阴性对照组注射等体积的生理盐水,用法同前。ADM剂量按8mg/kg腹腔注射,d1。每组5只,观察带瘤生存期。其余分别于停药后的第2d断颈处死,部分眼球取血观察肝肾功能、心肌酶谱和血常规的变化;测量肿瘤大小,计算抑瘤率;留取部分瘤组织、心、肝、肺、肾组织标本,行组织学检查和透射电镜观察,TUNEL法检测瘤细胞凋亡指数,免疫组化(SP)法检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达。第二部分 Bufalin对人肝癌细胞BEL-7402生长抑制及诱导凋亡作用(1)采用 MTT法分别检测不同浓度的蟾毒灵(10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)作用24h、48h、72h对人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50);(2)取3个不同浓度(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L)蟾毒灵处理细胞,倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学及超微结构的改变;(3)流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率;(4)TUNEL法检测凋亡指数;(5)琼脂糖凝胶电泳法观察凋亡梯状带情况。第三部分 Bufalin对人肝癌细胞凋亡相关基因bcl-2/bcl-2 mRNA、bax/bax mRNA表达及对凋亡信号传导通路NF-κB/p38MAPK的影响分别收集不同浓度(10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L)的蟾毒灵处理48h 的BEL-7402细胞,免疫组化(SP法)检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达,计算阳性细胞计数率;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测蟾毒灵对细胞bcl-2 mRNA及bax mRNA 表达,探讨蟾毒灵诱导细胞凋亡与凋亡相关蛋白bcl-2及bax表达的关系及对bcl-2 mRNA及bax mRNA基因转录的影响。 <WP=9>收集以上3个浓度蟾毒灵处理24h和48h的BEL-7402细胞,凝胶电泳迁移率变化分析法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测NF-κB活性,Westernblotting检测 p38MAPK活性,初步探讨蟾毒灵诱导肝癌细胞凋亡与凋亡信号传导通路NF-κB/p38MAPK的关系。四、研究结果第一部分 1.Bu抗肿瘤剂量的确定:2mg/kg剂量的Bu给予小鼠第1次腹腔注射后约5min内3只出现痉挛性抽搐,其余3只出现短暂的精神萎靡,第2次注射后仅出现短暂的萎靡,约3-5min后恢复正常。其他两组均未出现明显毒性反应。将Bu抗肿瘤的大、中、小剂量定为1.5mg/kg、1mg/kg和0.5mg/kg,是安全的。2.两种原位移植肝癌模型治疗前组间的肿瘤体积无显著性差异(P>0.05),使各组治疗前肿瘤大小具有可比性。Bu对两种原位移植肝癌模型均具有显著的抗肿瘤作用,Bu各组和ADM组瘤体均明显缩小(与NS组相比,P<0.01);Bu组平均生存期均有所延长,以Bu1-2组较为明显(与NS组相比,P<0.05及P<0.01)。ADM对小鼠原位移植性肝癌抑瘤率优于裸鼠人原位移植性肝癌(93.2%vs67.3%),但其对两种模型的平均生存期无明显延长(与NS组相比,P>0.05);B