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牛结核病(bovine tuberculosis)是一种死亡率极高的慢性人畜共患传染病,对公共卫生具有极大的威胁。1882年罗伯特·科赫发现了结核病发病主要是因为感染了结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB),其中一定比例都是牛结核分枝杆菌引起的。牛结核分枝杆菌抗干旱抗低温,具有较强的耐药性,可以在恶劣的环境下生存,对牛结核病的防治造成了困难。1993年,比利时科学家Hamers发现骆驼体内存在一种天然缺失轻链的重链抗体,仅由其可变区组成的抗体称为单域抗体,又称为VHH抗体。VHH抗体具有高亲和力、高稳定性、强组织穿透性、高效表达等优点。因此构建抗牛结核分枝杆菌VHH抗体库,并利用噬菌体展示技术和蛋白芯片对接技术获得高表达、特异性强的VHH抗体,为诊断与治疗结核病奠定基础。本文的主要研究结果如下:1.牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白的表达、纯化。采用BL21(DE3)(pET28a-ag85B)重组菌株,经表达、纯化、复性,获得具有活性的高浓度Ag85B蛋白。2.抗牛结核分枝杆菌VHH抗体库的构建及鉴定。实验使用BCG免疫骆驼,从骆驼外周血中分离淋巴细胞提取总RNA并反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增VHH抗体基因片段。将目的基因片段和pCANTAB5e载体用Not Ⅰ和Sfi Ⅰ进行双酶切,用T4连接酶进行连接,转化进TG1大肠杆菌内,构建VHH抗体初级文库。对建立的VHH抗体库进行鉴定,文库库容为7.35×106。随机挑选24个单菌落进行菌液PCR,结果表明文库阳性率为91.7%。通过DNAMAN分析氨基酸序列,氨基酸序列同源性为66.48%。说明构建获得的VHH抗体库多样性丰富,库容大小足以满足特异性抗体的筛选。3.抗牛结核分枝杆菌Ag85B特异性VHH抗体的筛选。以Ag85B蛋白为抗原,利用噬菌体表面展示技术的原理,使用M13K07辅助噬菌体进行“吸附-洗脱-扩增”的淘选。经过三轮淘选后富集度达到102。以Ag85B蛋白为抗原通过蛋白芯片互作的方法随机挑取大量单克隆进行检测,筛选到对Ag85B蛋白具有高度特异性的VHH抗体。本研究利用BCG免疫骆驼,提取总RNA,构建VHH抗体库;以Ag85B对抗体文库进行三轮亲和筛选;利用蛋白芯片互作技术筛选到具有高亲和力的抗Ag85B的VHH抗体,为进一步探讨VHH抗体在结核病的诊断与治疗的研究过程中奠定了基础。