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目的:研究诱导膜蛋白联合丹参提取物促进大鼠BMSCs成骨分化的作用,探讨诱导膜蛋白、丹参提取物促进BMSCs成骨分化作用与HIF-1α信号通路的关系。
方法:将实验分为空白组、丹参提取物组(实验组1)、诱导膜蛋白组(实验组2)、诱导膜蛋白联合丹参提取物组(实验组3),采用不同的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞。空白组:用完全培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素溶液)培养细胞。实验组1:用含有浓度为0.8mg/ml丹参提取物的完全培养基培养细胞。实验组2:用含有浓度为100μg/ml诱导膜蛋白的完全培养基培养细胞。实验组3:用含有浓度为100μg/ml诱导膜蛋白和浓度为0.8mg/ml丹参提取物的完全培养基培养细胞。采用以上不同培养方法培养BMSCs1周后,用CCK-8检测各组细胞增殖情况;倒置显微镜观察各组细胞形态变化;茜素红染色检测各组细胞矿化结节形成并选取3个视野进行计数,实时定量RT-PCR检测各组细胞成骨标志物( Runx-2、Col1、OCN)基因的表达水平,Western blot检测各组细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白的表达水平,Western blot检测各组细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白的表达水平。
结果:①通过CCK-8实验检测发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞在培养24h、48h、72h后,细胞的增殖无明显影响(P>0.05);②细胞形态变化,在倒置显微镜下可以看出:空白组的细胞呈长梭形,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞则变成梭形或短梭形,其中一些呈现鳞片状或多边形,可以看出经丹参提取物、诱导膜蛋白处理的细胞在形态上发生了变化,初步说明BMSCs已向成骨方向分化。③根据茜素红染色图片及计数可以看出,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的矿化结节数量明显增多;与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞矿化结节明显增多,矿化结节着色加深;与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞的矿化结节明显增多。④实时定量RT-PCR检测发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。⑤ Western blot实验发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。⑥Western blot实验发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞 HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:1.丹参提取物能促进大鼠BMSCs细胞成骨分化。
2.诱导膜蛋白能促进大鼠BMSCs细胞成骨分化。
3.与丹参提取物相比,诱导膜蛋白促进大鼠BMSCs细胞成骨分化作用更强。
4.与丹参提取物、诱导膜蛋白相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物培养的大鼠BMSCs成骨分化作用更强。
5.丹参提取物、诱导膜蛋白促进BMSCs成骨分化可能与激活HIF-1α信号通路有关。
方法:将实验分为空白组、丹参提取物组(实验组1)、诱导膜蛋白组(实验组2)、诱导膜蛋白联合丹参提取物组(实验组3),采用不同的培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞。空白组:用完全培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素溶液)培养细胞。实验组1:用含有浓度为0.8mg/ml丹参提取物的完全培养基培养细胞。实验组2:用含有浓度为100μg/ml诱导膜蛋白的完全培养基培养细胞。实验组3:用含有浓度为100μg/ml诱导膜蛋白和浓度为0.8mg/ml丹参提取物的完全培养基培养细胞。采用以上不同培养方法培养BMSCs1周后,用CCK-8检测各组细胞增殖情况;倒置显微镜观察各组细胞形态变化;茜素红染色检测各组细胞矿化结节形成并选取3个视野进行计数,实时定量RT-PCR检测各组细胞成骨标志物( Runx-2、Col1、OCN)基因的表达水平,Western blot检测各组细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白的表达水平,Western blot检测各组细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白的表达水平。
结果:①通过CCK-8实验检测发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞在培养24h、48h、72h后,细胞的增殖无明显影响(P>0.05);②细胞形态变化,在倒置显微镜下可以看出:空白组的细胞呈长梭形,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞则变成梭形或短梭形,其中一些呈现鳞片状或多边形,可以看出经丹参提取物、诱导膜蛋白处理的细胞在形态上发生了变化,初步说明BMSCs已向成骨方向分化。③根据茜素红染色图片及计数可以看出,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的矿化结节数量明显增多;与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞矿化结节明显增多,矿化结节着色加深;与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞的矿化结节明显增多。④实时定量RT-PCR检测发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)基因表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。⑤ Western blot实验发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞成骨标志物(Runx-2、Col1、OCN)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。⑥Western blot实验发现,与空白组相比,丹参提取物组、诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞 HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与丹参提取物组相比,诱导膜蛋白组、诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);与诱导膜蛋白组相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物组的细胞HIF-1α及下游因子(iN?OS、TGF-β、VEGF)蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:1.丹参提取物能促进大鼠BMSCs细胞成骨分化。
2.诱导膜蛋白能促进大鼠BMSCs细胞成骨分化。
3.与丹参提取物相比,诱导膜蛋白促进大鼠BMSCs细胞成骨分化作用更强。
4.与丹参提取物、诱导膜蛋白相比,诱导膜蛋白联合丹参提取物培养的大鼠BMSCs成骨分化作用更强。
5.丹参提取物、诱导膜蛋白促进BMSCs成骨分化可能与激活HIF-1α信号通路有关。