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目的:本实验通过冠状动脉前降支结扎术方法建立心力衰竭(心衰)大鼠模型,选用心脏超声仪器、多道生理仪及力竭游泳实验方法分别评价优化新生脉散方对心衰大鼠心功能的影响;基于TUNEL法、Western Blot等技术检测心肌细胞凋亡及相关调控蛋白的表达,探讨优化新生脉散方改善心衰大鼠心功能的分子生物学机制,为优化新生脉散方防治心衰提供科学依据。研究方法:实验动物选取正常健康的Wistar大鼠(雄性)100只,体重约200～240g,采用予冠状动脉前降支结扎术方法建立心梗后心衰大鼠模型,术后6周采用VEVO2100超声心动图(MS-250)评价成模情况,即左室射血分数(Left Ventricular Ejection Fractions,LVEF)≤45%造模成功。将符合实验标准的心衰大鼠模型采用随机分组分为模型组、西药组、中药中剂量组、中药高剂量组;另外取正常大鼠予冠状动脉前降支部位只穿线不结扎,设为假手术组。西药组予以盐酸贝那普利(0.9mg/kg)干预,中药各组给予优化新生脉散方(中剂量8.1g生药/kg,高剂量16.2g生药/kg)干预,模型组与假手术组给予同等剂量的空白溶剂(0.5%CMC-Na),各组均灌胃给药,给药共计4周。给药前及末次给药12h后,采用VEVO2100超声心动仪测定LVEF、左室短轴缩短率(Left Ventricular Fraction Shortening,LVFS);左心室压力-容积环检测定左室内压上升或下降最大速率(±dp/dtmax)等指标评价心功能;对各组心衰大鼠进行称重,并将铅条(5%体质量)卷成小块束于心衰大鼠尾根部,放入加水的塑料水槽中,水深为大鼠尾巴长度的3倍,水温恒温为(25-29)℃,大鼠进入水槽后开始计时,直到大鼠头部沉入水中10s不能浮出水面(处于体力耗竭状态)的时间,以游泳时长作为大鼠心功能的评价指标。处死大鼠,留取心肌组织于甲醛溶液中固定和液氮中保存。采用TUNEL法染色,在显微镜下观察各组组织切片上细胞,染色显示绿色细胞是阳性凋亡细胞,细胞核蓝色的是正常细胞;采用免疫荧光法测定Caspase-3蛋白酶体活性,即细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红光;Western Blot蛋白印迹法技术检测细胞凋亡相关调控蛋白PI3K、Akt、JNK、Bcl-2、Bax、Caspase-3等表达。评价优化新生脉散方对心衰大鼠心功能的影响,并浅析其作用机制。研究结果:1优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心功能的影响(1)心脏超声指标:与假手术组相比,术后6周即给药前模型组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组大鼠的LVEF和FS明显下降(P<0.01);给药4周后,模型组的LVEF、FS较假手术组相比明显降低(P<0.01);与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组LVEF、FS明显升高(P<0.01);西药组、中药中剂量组及中药高剂量组组间无统计学差异(P>0.05)。(2)血流动力学指标:与假手术组照组比,模型组±dp/dtmax(mmHg/s)明显降低(P<0.01);经药物干预后,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组±dp/dtmax(mmHg/s)较模型组明显升高(P<0.01);西药组与中药各组间无统计学差异(P>0.05)。(3)力竭游泳实验指标:与假手术组相比,模型组游泳时长显著降低(P<0.01);与模型组相比,中药中剂量组、中药高剂量组、西药组游泳时长均明显提高(P<0.01);而中药剂量组与西药组有增加的趋势但无统计学差异(P>0.05)。2 基于PI3K/Akt信号通路探讨优化新生脉散方改善心衰大鼠心功能影响的分子生物学机制的研究(1)TUNEL染色各组大鼠心肌的凋亡表达各组心衰大鼠心肌组织经TUNEL染色后,假手术组可见少量绿色荧光细胞;而模型与假手术组相比较心肌组织有大量阳性绿色荧光的细胞;与模型组相比,中药中剂量组、中药高剂量组、西药组心肌阳性绿色荧光的细胞较少。与假手术组相比,模型组的心肌细胞凋亡率显著增加(P<0.01);与模型组相比,西药组、中药中剂量组及中药高剂量组心肌细胞凋亡率情况显著减少(P<0.01);西药组与中药各组间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)各组心衰大鼠心肌组织经荧光比色法检测Caspase-3活性表达与假手术组相比,模型组显示染红色荧光的细胞核的细胞较多;与模型组相比,中药中剂量组显示染红色荧光的细胞核的细胞较少,而西药组、中药高剂量组同样观察到少量染红色荧光的细胞核的细胞。各组大鼠心肌组织由荧光染色后,与假手术组相比,模型组的Caspase-3蛋白显著增加(P<0.01);与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组Caspase-3蛋白显著减少(P<0.01);中药中剂量组、高剂量组与西药组间无统计学差异(P>0.05)。(3)各组心衰大鼠心肌组织PI3K、Akt蛋白及p-PI3K、p-Akt磷酸化水平表达:各组PI3K、Akt总蛋白水平无统计学差异(P>0.05);与假手术组对比,模型组p-PI3K、p-Akt磷酸化水平降低(P<0.05);与模型组相比,西药组、中药中剂量组、中药高剂量组p-PI3K、p-Akt磷酸化水平升高(P<0.05);西药组与中药中剂量组及中药高剂量组间无统计学差异(P>0.05)。(4)各组心衰大鼠心肌组织JNK蛋白表达:与假手术组对比,模型组JNK蛋白表达升高(P<0.05);西药组、中药中剂量组、中药高剂量组JNK蛋白表达较模型组明显下降(P<0.05);西药组与中药各组间无统计学差异(P>0.05)。(5)各组心衰大鼠心肌组织的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达:与假手术组对比,模型组心肌组织Bax、Caspase-3表达升高,Bcl-2下降(P<0.01);西药组与中药中剂量组、中药高剂量组心肌组织Bax、Caspase-3蛋白表达较模型组明显下降,Bcl-2升高(P<0.01或P<0.05);西药组与中药各组间无统计学差异(P>0.05)。结论:1.优化新生脉散方可改善心肌梗死后心衰大鼠心功能。2.优化新生脉散方对心肌细胞凋亡有明显的抑制作用,其作用机制可能是促进PI3K/Akt信号通路激活,同时抑制靶点JNK信号通路激活,JNK通路失活并抑制下游基因Bax和Caspase-3蛋白的表达调控心肌细胞凋亡,同时提升Bcl-2蛋白予抗细胞凋亡。表明优化新生脉散方可以通过PI3K/Akt通路抑制心衰大鼠心肌细胞凋亡,推测该通路可作为优化新生脉散方治疗心力衰竭的分子机制研究之一。