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研究目的：
胃癌是在全世界范围内死亡率和发病率都很高的一种恶性肿瘤，且胃癌早期症状不明显诊断方法又缺乏特异性，已有的肿瘤标志物如癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、糖抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CA19-9)等在胃癌中的检出性均不高。因此，寻找利于早期诊断和治疗的胃癌标志物一直是胃癌研究领域的热点。
随着肿瘤分子生物学技术的发展，人们发现tRNA衍生小RNA(tRNA-derived small RNA,tsRNA)具有重要的生物学功能，曾一度被误认为是tRNA随机降解的产物，但近年来研究发现，它们在疾病诊断与新型治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。tsRNA主要包括tRNA衍生片段(tRNA-derived RNA fragment,tRF)和tRNA半分子(tRNA half,tiRNA)。
本研究先对胃癌相关tRF和tiRNA进行筛选和鉴定，然后对它们在胃癌诊断中的价值进行分析，希望发现新型胃癌早期分子诊断标志物；并进一步通过体内、体外实验探究它们影响胃癌发生的机制。
研究方法：
1.结合MINTbase数据库，筛选胃癌相关tRF和tiRNA，分别确定tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2为本课题的研究对象，重点研究它们与胃癌发生的关系。
2.收集86对胃癌患者手术组织和相应的癌旁组织标本、37对胃癌患者术前1天及术后7天血浆和37个正常人的血浆标本。
3.先对RNA去修饰和加接头，然后采用定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测胃癌组织、血浆和细胞中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平。
4.分析tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平与胃癌患者临床病理因素的关系，分析其临床诊断价值。
5.设计tRF-5026a的类似物和抑制剂，用转染试剂Lipofectamine2000转入细胞中。qRT-PCR检测tRF-5026a的表达水平变化。
6.细胞转染tRF-5026a的类似物和抑制剂后，先通过细胞计数试剂-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和克隆形成实验检测细胞增殖能力；再通过划痕实验和Trans-well实验检测细胞迁移能力；最后通过流式细胞术检测细胞的凋亡和周期。
7.Western blot实验检测上调和下调tRF-5026a的表达水平后，PTEN/PI3K/AKT通路中相关蛋白的表达水平变化以及一些周期相关蛋白的表达情况。
8.通过裸鼠皮下成瘤实验，观察上调tRF-5026a后肿瘤重量和体积的变化，并观察肿瘤转移情况。
研究结果：
1.qRT-PCR的实验结果表明，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌组织中均低表达且在临床病理因素分析中发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平与一些主要临床病理因素有关。tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌患者术前1天和术后7天血浆标本的表达情况均相对于正常人也是低表达的。tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌细胞株中相对于正常胃黏膜上皮细胞株均为低表达。
2.进一步分析表明，在胃癌患者组织中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)下面积(the area under the ROC curve,AUC)分别为0.631和0.779；在胃癌患者血浆中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的AUC分别为0.883和0.835。当tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2分别在组织和血浆中的AUC组合以后发现，AUC几乎都有所增大。这说明tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2均能作为胃癌的一种新型标志物。
3.生存曲线分析发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2低表达组的总体生存率比高表达组的低。多因素分析发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2是一个独立预后因素。
4.上调和下调tRF-5026a的表达水平以后，CCK-8和克隆形成实验结果显示，细胞增殖能力分别下降和升高；划痕实验和Trans-well实验结果显示，细胞的迁移能力分别降低和升高；流式细胞术检测细胞凋亡和周期实验结果后发现，细胞凋亡率分别升高和降低，细胞周期分别阻滞在G0/G1期和G2/M期。
5.Western blot实验表明，上调和下调tRF-5026a的表达水平以后，PTEN分别升高和下降，而PI3K和AKT均分别下降和升高；Cyclin D1分别下降和升高；P21和P27均分别升高和下降。
6.裸鼠皮下成瘤实验结果发现，上调tRF-5026a后肿瘤生长速度减慢，肿瘤体积变小，且呈剂量依赖效应。
研究结论：
1.tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌组织、血浆和细胞中均为低表达，它们的表达与胃癌患者的主要临床病理因素密切相关，是胃癌新型候选标志物和预后标志物，具有一定的诊断价值，可用于预测总体生存率。
2.体外细胞实验表明，tRF-5026a通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路和周期相关蛋白抑制胃癌细胞增殖、迁移能力和周期进展。
3.裸鼠胃癌皮下成瘤实验表明，上调tRF-5026a后能有效抑制肿瘤的生长。
总之，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2是胃癌相关的tRF和tiRNA，有希望成为胃癌诊断的新型标志物；tRF-5026a具有抑制胃癌细胞增殖、迁移和周期进展等作用。
胃癌是在全世界范围内死亡率和发病率都很高的一种恶性肿瘤，且胃癌早期症状不明显诊断方法又缺乏特异性，已有的肿瘤标志物如癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、糖抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CA19-9)等在胃癌中的检出性均不高。因此，寻找利于早期诊断和治疗的胃癌标志物一直是胃癌研究领域的热点。
随着肿瘤分子生物学技术的发展，人们发现tRNA衍生小RNA(tRNA-derived small RNA,tsRNA)具有重要的生物学功能，曾一度被误认为是tRNA随机降解的产物，但近年来研究发现，它们在疾病诊断与新型治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。tsRNA主要包括tRNA衍生片段(tRNA-derived RNA fragment,tRF)和tRNA半分子(tRNA half,tiRNA)。
本研究先对胃癌相关tRF和tiRNA进行筛选和鉴定，然后对它们在胃癌诊断中的价值进行分析，希望发现新型胃癌早期分子诊断标志物；并进一步通过体内、体外实验探究它们影响胃癌发生的机制。
研究方法：
1.结合MINTbase数据库，筛选胃癌相关tRF和tiRNA，分别确定tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2为本课题的研究对象，重点研究它们与胃癌发生的关系。
2.收集86对胃癌患者手术组织和相应的癌旁组织标本、37对胃癌患者术前1天及术后7天血浆和37个正常人的血浆标本。
3.先对RNA去修饰和加接头，然后采用定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测胃癌组织、血浆和细胞中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平。
4.分析tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平与胃癌患者临床病理因素的关系，分析其临床诊断价值。
5.设计tRF-5026a的类似物和抑制剂，用转染试剂Lipofectamine2000转入细胞中。qRT-PCR检测tRF-5026a的表达水平变化。
6.细胞转染tRF-5026a的类似物和抑制剂后，先通过细胞计数试剂-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和克隆形成实验检测细胞增殖能力；再通过划痕实验和Trans-well实验检测细胞迁移能力；最后通过流式细胞术检测细胞的凋亡和周期。
7.Western blot实验检测上调和下调tRF-5026a的表达水平后，PTEN/PI3K/AKT通路中相关蛋白的表达水平变化以及一些周期相关蛋白的表达情况。
8.通过裸鼠皮下成瘤实验，观察上调tRF-5026a后肿瘤重量和体积的变化，并观察肿瘤转移情况。
研究结果：
1.qRT-PCR的实验结果表明，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌组织中均低表达且在临床病理因素分析中发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的表达水平与一些主要临床病理因素有关。tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌患者术前1天和术后7天血浆标本的表达情况均相对于正常人也是低表达的。tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌细胞株中相对于正常胃黏膜上皮细胞株均为低表达。
2.进一步分析表明，在胃癌患者组织中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)下面积(the area under the ROC curve,AUC)分别为0.631和0.779；在胃癌患者血浆中tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2的AUC分别为0.883和0.835。当tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2分别在组织和血浆中的AUC组合以后发现，AUC几乎都有所增大。这说明tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2均能作为胃癌的一种新型标志物。
3.生存曲线分析发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2低表达组的总体生存率比高表达组的低。多因素分析发现，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2是一个独立预后因素。
4.上调和下调tRF-5026a的表达水平以后，CCK-8和克隆形成实验结果显示，细胞增殖能力分别下降和升高；划痕实验和Trans-well实验结果显示，细胞的迁移能力分别降低和升高；流式细胞术检测细胞凋亡和周期实验结果后发现，细胞凋亡率分别升高和降低，细胞周期分别阻滞在G0/G1期和G2/M期。
5.Western blot实验表明，上调和下调tRF-5026a的表达水平以后，PTEN分别升高和下降，而PI3K和AKT均分别下降和升高；Cyclin D1分别下降和升高；P21和P27均分别升高和下降。
6.裸鼠皮下成瘤实验结果发现，上调tRF-5026a后肿瘤生长速度减慢，肿瘤体积变小，且呈剂量依赖效应。
研究结论：
1.tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌组织、血浆和细胞中均为低表达，它们的表达与胃癌患者的主要临床病理因素密切相关，是胃癌新型候选标志物和预后标志物，具有一定的诊断价值，可用于预测总体生存率。
2.体外细胞实验表明，tRF-5026a通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路和周期相关蛋白抑制胃癌细胞增殖、迁移能力和周期进展。
3.裸鼠胃癌皮下成瘤实验表明，上调tRF-5026a后能有效抑制肿瘤的生长。
总之，tRF-5026a和tiRNA-5034-GluTTC-2是胃癌相关的tRF和tiRNA，有希望成为胃癌诊断的新型标志物；tRF-5026a具有抑制胃癌细胞增殖、迁移和周期进展等作用。