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研究目的1、探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬的作用。2、明确ox-LDL诱导的HUVECs中长链非编码RMA MALAT1的表达水平及PI3K/AKT信号通路的活化情况。3、探讨MALAT1对ox-LDL诱导的HUVECs自噬的影响,以及对PI3K/AKT通路的调节作用。研究方法1、用浓度100ug/ml的ox-LDL孵育HUVECs 12h后收集细胞,利用Western blot技术检测HUVECs中自噬相关蛋白LC3-II的表达水平,采用免疫荧光染色法在激光共聚焦显微镜下观察细胞中LC3蛋白的点状聚集情况,利用透射电镜观察HUVECs中自噬体的形态及数量变化;以及检测加入溶酶体抑制剂Bafilomycin A1预处理的细胞中LC3-II的表达水平、LC3蛋白的点状荧光聚集情况、自噬体形态及数目的变化。2、用浓度100ug/ml的ox-LDL处理HUVECs 12h后,采用q RT-PCR技术检测细胞中MALAT1表达水平,采用Western blot方法检测p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、RHEB、p-p70S6K、p70S6K蛋白在细胞中的表达变化。3、采用脂质体转染法将MALAT1表达载体及其阴性对照转染至脐静脉内皮细胞,24h后再用100ug/ml的ox-LDL孵育脐静脉内皮细胞12h,利用Western blot技术、免疫荧光染色法及透射电镜观察MALAT1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs自噬的影响,利用Western blot技术观察MALAT1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs中PI3K/AKT通路的重要标志蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、RHEB、p-p70S6K、p70S6K表达的影响。采用RNAi技术,利用脂质体转染法将MALAT1的小干扰RNA(si MALAT1)及其阴性对照(si Control)转染至HUVECs,敲低MALAT1的表达,24h后再用ox-LDL处理HUVECs 12h,利用Western blot技术、免疫荧光染色法及透射电镜观察其对ox-LDL诱导的HUVECs自噬及PI3K/AKT通路的影响。研究结果1、ox-LDL孵育HUVECs 12 h后,Western blot结果显示细胞中自噬相关蛋白LC3-II的表达上调,免疫荧光染色法观察到细胞中LC3的点状荧光聚集增多,透射电镜下观察到自噬体的数目增多;另外,在Bafilomycin A1存在下,ox-LDL处理HUVECs增加了细胞LC3-II蛋白表达水平、LC3蛋白点状荧光聚集及自噬体数目。2、ox-LDL处理HUVECs后,q RT-PCR结果显示细胞中MALAT1的表达升高;Western blot结果显示细胞中p-PI3K、p-AKT、RHEB、p-p70S6K表达下降,而PI3K、AKT、P70S6K的总蛋白无明显变化。3、将MALAT1过表达载体转入HUVECs后,再用ox-LDL孵育细胞12h,Western blot结果显示细胞中LC3-II蛋白表达增加,免疫荧光染色结果示LC3蛋白点状荧光聚集增多,电镜下观察到细胞中自噬体数目增加,Western blot结果显示细胞中p-PI3K、p-AKT、RHEB、p-p70S6K蛋白的表达水平进一步下降,PI3K、AKT、P70S6K总蛋白无显著变化;而MALAT1 si RNA能够降低ox-LDL诱导的HUVECs中LC3-II蛋白表达水平、LC3蛋白点状荧光聚集及自噬体数目,升高细胞中PI3K、AKT、p70S6K蛋白的磷酸化水平及RHEB蛋白的表达。研究结论Ox-LDL能激活HUVECs自噬,升高细胞中MALAT1表达并抑制PI3K/AKT通路的活化。MALAT1可能通过调控PI3K/AKT通路调节ox-LDL介导的HUVECs自噬。