论文部分内容阅读
果胶裂解酶是切割多聚半乳糖醛酸α-1,4-糖苷键的一种酶类,能有效水解果胶及果胶类物质,在造纸、纺织、食品、饲料、洗涤等方面都有重大的应用价值。目前应用在工业中的果胶裂解酶大多为中温或者高温的果胶酶,反应能耗较多,因此寻找新的低温果胶裂解酶是一件非常有意义的事情。一、低温碱性果胶裂解酶PEL1编码基因的克隆、酶学表征与发酵条件优化。Massilia eurypsychrophila是分离自南极阿斯曼丘陵的一个低温菌,对其进行全基因组测序分析后发现了一个新的果胶裂解酶基因pel1,氨基酸序列分析表明该基因编码的果胶酶属于多糖水解酶第6超家族,与已报告的果胶裂解酶同源性最高有66%。本研究成功地将PEL1在大肠杆菌中异源分泌表达,纯化以后对其进行酶学性质分析,重组蛋白约为34.7 KDa,对多聚半乳糖醛酸有较高的活性,最适反应温度为30℃,最适反应p H为p H 10.0,在10℃到40℃之间可以保持60%以上的相对活性,特别的是PEL1在0℃也有25%的相对活性,在30℃保持30分钟后,保留了70%以上的活性,但是在40℃预处理10分钟后,该酶的活性几乎完全丧失。PEL1的比活力为78.75 U/mg,动力学参数Km为0.930 g/L,Vmax为33.6μmol/min,kcat为46.67/s,在反应体系中加入浓度为0.5 m M的钙离子时,比活力提高了1.24倍。通过诱导温度、IPTG浓度以及不同发酵培养基等发酵条件的优化,确定了PEL1表达的最佳诱导条件,即使用TB培养基、在18℃摇瓶诱导30 h,能达到最好的分泌表达效果。二、低温碱性果胶裂解酶PEL1低温机制的初步探索。我们首先将PEL1与其同源性最高的果胶酶(PLXc)进行二级结构的比对,发现PEL1中不规则卷曲占比较多（51%>45%）,而β-折叠所占比例较小（30%<36%）,表明PEL1的蛋白结构更加灵活。因此我们重新合成了PLXc的基因,分别将PLXc190-193I、PLXc205-219II、PLXc279-284III、PLXc296-300IV这四个位于不规则卷曲区域的序列按照PEL1的序列进行突变,其中PLXc190-193I和PLXc205-219II的突变片段靠近活性位点,PLXc279-284III和PLXc296-300IV的突变片段位于蛋白质结构外围的环区域。将这4个突变体在大肠杆菌中表达纯化后,进行酶学性质的分析,结果显示所有突变体的热稳定性都有下降,其中突变体PLXc279-284III的热稳定性下降幅度最大,表明该几个区域对酶的热稳定性均有明显影响。本文进一步分析了突变体PLXc279-284III的最适p H,结果显示,PLXc279-284III的最适p H从原始的8.5上升到9.5,说明这段区域不仅影响蛋白质的最适反应温度,同时也影响其最适反应p H。本文进一步通过B-factor研究了具体位点对PLXc热稳定性的影响。选择了在结构上位于活性位点10?以内、相对B-factor大于0、处于不规则卷曲并暴露在外的氨基酸位点分别进行点突变,突变体分别为PLXcD184E/S185K、PLXcK188L、PLXcK250R、PLXc259-261。酶学性质分析结果显示突变体PLXc259-261热稳定性变化不大,而突变体PLXcD184E/S185K、PLXcK188L、PLXcK250R在45℃的热稳定性急剧下降,处理20 min时,突变体活性都有下降,其中PLXcD184E/S185K的变化最为明显,在45℃处理10 min后活性下降了近50%,20 min后活性仅剩20%左右,30 min后活性几乎全部丧失,而PEL1在45℃处理30 min酶活全部丧失,说明184和185位点对热稳定性影响很大。有的文献报道,将V187突变为I后,PLXcV187I在45℃的半衰期从54.2分钟缩短至不到10分钟。本文通过序列比对发现PEL1相应第164位的氨基酸也是I,因此继续研究了164I位点对于酶的热稳定性的影响,通过对PEL1和突变体PEL1 I164V,PLXc和突变体PLXcV187I最适温度的分析比较,结果表明PEL1 I164V的最适温度从30℃提高到40℃,而PLXcV187I的最适温度从50℃(PLXc)降至35℃。此外,在40℃预热10 min后,PEL1 I164V依然保持了44%的活性,而PEL1则失去大部分活性。这表明164位点也可能是影响PEL1的热稳定性的重要氨基酸残基之一。三、果胶酶PEL1的热稳定性改造。基于对PEL1与PLXc结构与序列的比较及突变实验的分析,我们选取了几个位点对PEL1进行突变,构建了一系列PEL1的突变体,其中PEL1 A50G/S51T、PEL1 L208V、PEL1 E184D/K185S和PEL1 L208V的突变位点都处于蛋白质结构的不规则卷曲位置,而PEL1 A8G、PEL1 Y213F和PEL1A8G/Y213F这几个突变体的突变位点已有文献证实对果胶酶的热稳定有影响。突变体PEL1 E184D/K185S的变化最显著,比活力提高了一倍,最适温度为40℃,在30℃保持80%以上的相对活性,在0℃也有20%的相对活性,热稳定性相对PEL1有大幅提高,在40℃放置10分钟仍有80%的相对活性,其Km下降到0.795 g/L,Vmax提高至36.9μmol/min,Kcat为112.3/s,Tm值由39.21℃提高到47.54℃。本文也同时分析了184与185单点突变的比活力与热稳定性,确定184、185位点需同时突变才能达到最好的效果,突变体PEL1 E184D/K185S是目前已知的比活力最高的低温果胶酶。综上所述,本文发现了一个新的低温果胶果胶裂解酶基因pel1,并在大肠杆菌中实现了分泌表达,对该果胶裂解酶PEL1进行了表征,初步探究了酶的低温机制,在此基础上对PEL1进行了分子改造,得到了比活力与热稳定性都提高的最优突变体PEL1 E184D/K185S。为该酶在工业中的应用奠定了良好的基础。