植物防御素类抗菌肽是植物机体非特异免疫系统的重要组成部分,近年研究发现其不仅具有广谱杀菌活性,大部分对人、畜、植物细胞没有危害,这表明其在医疗卫生、食品、基因育种等应用方面具有巨大潜力。防御素PaDef (AP02332)是从鳄梨果实中分离的含有45个氨基酸的多肽。本研究利用毕赤酵母表达的防御素PaDef进行一系列的活性研究试验,在此基础上进行定点突变,以期获得性能更好的抗菌肽。研究结果如下:(1)诱导时间优化中,在0-120 h范围内,抗菌肽PaDef随时间的增加蛋白表达量增加,但72, 96, 120 h的上清液对金黄色葡萄球菌抑菌效果无显著差异(P>0.05),分别为62.5%,65.6%,56.2%。综合时间、成本等各方面因素,最终确定72 h为其最适诱导时间。甲醇浓度优化中,用0.5%, 1%,1.5%,2%这四个浓度分别进行诱导表达,甲醇浓度为1.5%时蛋白浓度最高为79.6μg/mL,且对金黄色葡萄球菌抑制作用达70.0%,故最终确定1.5%为最优甲醇诱导浓度。(2)抗菌肽PaDef进行最小抑菌试验(MIC)中,其对11株菌均有抑菌活性,且当浓度达到120μg/mL时(纯度>97%),受试菌抑制率均达90%以上。在温度、PH值、蛋白酶稳定性试验中,PaDef的活性仅在PH值为酸性和胃蛋白酶组受到影响外,碱性、温度(4℃～90℃)、蛋白酶(木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶)处理组均不影响其活性。这表明PaDef具有较好的稳定性。(3)定点突变试验中,成功表达突变株PaDef-T3R、PaDef-D29R、PaDef-Q33H、PaDef-K43M。MIC活性研究发现,除PaDef-D29R对大肠埃希菌的MIC值低于野生型外,其他突变株的活性均有所提高。其中PaDef-Q33H效果格外明显,在30μg/mL时,针对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、单增李斯特菌(ATCC 21633)、大肠0157(ATCC 35150)、大肠埃希菌(ATCC 10305)的抑菌率分别能够达到97.7%、95.9%、99.1%、65.8%(40 μg/mL时达98.5%),这相较野生型大大提高。在琼脂糖扩散实验中,我们观察相似结果:60μg/mL时,PaDef-Q33H、PaDef-K43M抑菌圈直径明显高于野生型。综上所述,PaDef具有广谱杀菌性,且具有温度、PH值(酸性除外)、蛋白酶(胃蛋白酶除外)稳定性。突变株PaDef-Q33H活性优于野生型。这不仅为后续深入试验提供经验基础,也为抗菌肽PaDef应用于食品、化妆品、毒理学研究及临床实验,提高实际应用的可行性。