猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种世界性传染病,每年都给养猪业造成巨大的经济损失。该综合症由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起;其特征表现为母猪繁殖力低,并伴随着呼吸障碍、仔猪生长缓慢、高发病率和高致死率等。目前防控PRRSV的主要方式是疫苗免疫,但由于病毒存在免疫逃逸机制和抗体依赖性增强效应,因而疫苗免疫的效果并不显著。研究表明,猪CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体。CD163蛋白第五结构域（SRCR5）是介导PRRSV与宿主细胞相互作用的关键结构域。在病毒的感染过程中,SRCR5与病毒GP2a、GP4蛋白二聚体结合,从而介导PRRSV入侵宿主细胞。因此SRCR5也是制备抗PRRSV克隆猪的良好的基因操作靶点。猪与人有着高度同源的基因序列,并且与人体器官在大小、功能、解剖学特征、生理学功能等方面也具有高度的相似性;因此,猪被认为是解决人类器官短缺的最理想的异种器官移植供体。然而,在临床实验程中,猪到非人灵长动物的异种器官移植会发生严重的超级性免疫排斥反应,从而使供体器官短时间内丧失功能,造成移植失败。目前发现的可引起免疫排斥反应的猪源细胞表面抗原主要有α-Gal（α-1,3半乳糖）、Neu5Gc（N-羟乙酰神经氨酸）和血型抗原Sd^a。近年来快速发展的CRISPR/Cas技术以及碱基编辑技术已经成功地被应用于多种动物,包括小鼠、斑马鱼、兔、猪、羊等。该技术在动物抗病育种及异种器官移植等领域显示出其重大的应用价值。本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术制备抗PRRSV的CD163基因修饰猪,探究BE4-Gam系统在猪基因编辑中的适用性并利用BE4-Gam系统制备α-Gal/Neu5Gc/Sd^a缺失猪,为今后构建异种移植抗原缺失猪提供新思考。本研究共包含三方面的实验内容。第一部分实验研究中,我们利用CRISPR/Cas9系统成功地用猪CD163SRCR3基因序列替换猪CD163 SRCR5基因序列,制备了CD163^SRCR3猪;利用CRISPR/Cas9系统制备了CD163 SRCR5敲除的CD163^E7D猪。后续实验结果表明,正常生理情况下,CD163^SRCR3猪和CD163^E7D猪两者血清中游离的Hp含量与野生型猪没有显著差异;并且CD163^SRCR3猪、CD163^E7D猪外周血单个核细胞（PBMCs）来源的巨噬细胞（PMMs）都具备对Hb-Hp复合物的清除能力。最后,我们分离了CD163^SRCR3猪、CD163^E7D猪和野生型猪来源的肺泡巨噬细胞（PAMs）用于体外感染HP-PRRSV。实时荧光定量结果显示,CD163^SRCR3猪、CD163^E7D猪来源的PAMs都可以有效的在体外抑制HP-PRRSV的增殖;与CD163^E7D猪相比,CD163^SRCR3猪来源的PAMs对HP-PRRSV的抑制作用更显著。在第二部分实验中,我们针对猪α-Gal、Neu5Gc和Sd^a等抗原合成基因GGTA、CMAH和B4GalNT2分别设计了一条相应的sgRNA,用以探究BE4-Gam系统在猪细胞内的适用性。实验结果表明,BE4-Gam系统在胎儿成纤维细胞（PFFs）和孤雌囊胚中GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因目的位点分别可实现5.3%-10.1%和66.7%-71.4%的单基因编辑效率;在PFFs和孤雌囊胚GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因目的位点分别可实现7.5%和18.1%的3基因编辑效率。同时,在实验过程中,BE4-Gam系统实现了单一的编辑产物,没有Indels现象发生。与BE4-Gam系统相比,我们进一步的研究表明AncBE4max系统在孤雌囊胚及胎儿成纤维细胞目的基因位点可以提升近5倍的单基因编辑效率,在胚胎水平可实现71.4%的3基因编辑效率。在第三部分实验中,我们利用BE4-Gam系统、SCNT技术和IVF技术获得了GGTA1、B4GalNT2、CMAH基因突变的F₀代克隆猪。对F₀代克隆猪的脱靶检测结果显示,在潜在脱靶位点我们未发现脱靶突变。IFA抗原检测结果也表明,我们成功制备了α-Gal、Neu5Gc和Sd^a同时缺失的巴马香猪仔猪。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9系统和BE4-Gam系统分别成功的制备了抗HP-PRRSV的CD163^SRCR3猪、CD163^E7D猪和α-Gal/Neu5Gc/Sd^a抗原缺失猪,为维护养猪业的稳定及生物医药的发展奠定了良好基础。本研究也证实了BE4-Gam系统在猪细胞内的适用性,为今后构建异种器官移植猪、更精确的动物性状改良及人类疾病模型的构建提供高效的技术手段。